Становление микробиоты кишечника доношенных и поздних недоношенных детей, рожденных самопроизвольно и путем операции кесарева сечения

Резюме

Кишечная микробиота оказывает влияние на физиологические процессы и поддержание гомеостаза организма человека. Нарушение состава микробиоты, в том числе в раннем возрасте, может приводить к различным заболеваниям. Становление микробиоты новорожденных, особенно недоношенных детей, зависит от многочисленных факторов и недостаточно изучено.

Цель работы - оценить динамику состава кишечной микробиоты в течение первого месяца жизни у доношенных и поздних недоношенных детей, рожденных самопроизвольно и путем операции кесарева сечения.

Материал и методы. Обследованы 100 доношенных новорожденных (49 детей, рожденных естественным путем, 51 - путем операции кесарева сечения) и 51 поздний недоношенный ребенок (25 детей, рожденных естественным путем, 26 - путем операции кесарева сечения). Образцы фекалий детей, полученные в 1, 7 и 30-е сутки жизни исследовали методом культуромики с идентификацией микроорганизмов методом MALDI-TOF MS и секвенирования участка гена 16S рРНК. Для статистического анализа использовали тест Манна-Уитни, медиану и интерквартильное расстояние.

Результаты. На протяжении 1-го месяца жизни у детей сравниваемых групп сохранялось существенное различие в показателях качественного и количественного состава кишечной микробиоты. Дети, рожденные естественным путем, уже в 1-е сутки жизни имели преимущество: в составе микробиоты выделены микроорганизмы из группы комменсалов (лактобациллы, бифидобактерии и бактероиды), в отличие от детей, рожденных путем операции кесарева сечения. На 7-е сутки жизни у детей всех групп в составе кишечной микробиоты строгие анаэробы преобладали над факультативными анаэробами, но у недоношенных детей и доношенных, рожденных оперативным путем, этот процесс происходил медленнее. К концу 1-го месяца жизни по уровню колонизации бактероидами дети, рожденные оперативным путем, более чем в 5 раз отставали от детей, рожденных путем самопроизвольных родов. Недоношенные дети, рожденные естественным путем, по уровню колонизации бифидобактериями и бактероидами приблизились к показателям доношенных детей, рожденных естественным путем. В группах недоношенных детей титр лактобацилл оставался стабильно высоким, преимущественно за счет пробиотических видов (Lactobacillus fermentum и Lactobacillus plantarum).

Заключение. В становлении кишечной микробиоты новорожденных наиболее значимым фактором является гестационный возраст. Вместе с тем кесарево сечение сдерживает процесс нормального становления кишечной микробиоты. Использование пробиотиков для лечения недоношенных детей помогает ускорить процесс формирования микробиоты.

Ключевые слова:микробиота кишечника; новорожденные; поздние недоношенные дети; культуромика; MALDI-TOF MS; секвенирование

Финансирование. Работа выполнена в рамках выполнения НИР "Сбор и характеристика биообразцов микробиоты кишечника доношенных и поздних недоношенных новорожденных детей" по договору с ФГБУ "ЦСП" ФМБА России от 10.06.2019 № 0373100122119000032.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Общее руководство - Припутневич Т.В., Зубков В.В., Николаева А.В., Макаров В.В., Юдин С.М.; микробиологические исследования, анализ данных - Исаева Е.Л., Муравьева В.В., Бембеева Б.О.; сбор биоматериала и информации - Месян М.К., Тимофеева Л.А., Козлова А.А.

Для цитирования: Припутневич Т.В., Исаева Е.Л., Муравьева В.В., Месян М.К., Зубков В.В., Николаева А.В., Бембеева Б.О., Тимофеева Л.А., Козлова А.А., Макаров В.В., Юдин С.М. Становление микробиоты кишечника доношенных и поздних недоношенных детей, рожденных самопроизвольно и путем операции кесарева сечения // Неонатология: новости, мнения, обучение. 2023. Т. 11, № 1. С. 42-56. DOI: https://doi.org/10.33029/2308-2402-2023-11-1-42-56

Статья поступила в редакцию 24.10.2022. Принята в печать 06.02.2023.

В настоящее время важность микробиоты кишечника для нормального функционирования всего организма человека не вызывает сомнений. Также общепризнана значимость правильного становления микробиоты кишечника с первых дней жизни. Вместе с тем до настоящего времени не определено, как именно происходит формирование кишечной микробиоты новорожденного. Тем более неясно, как этот процесс осуществляется у недоношенных детей и в каких случаях требуется его коррекция. Актуальность данного вопроса связана с тем, что ежегодно в мире рождаются 15 млн недоношенных детей, из них 1 млн детей умирают [1]. Для углубленного понимания проблемы мы провели сравнительное изучение становления кишечной микробиоты (КМ) в течение первого месяца жизни у здоровых доношенных и поздних недоношенных новорожденных с использованием методов культуромики, матрично-активированной лазерной десорбционно/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) и молекулярно-генетических методов (секвенирование участка гена 16S рРНК).

Цель работы - оценить динамику состава КМ в течение первого месяца жизни у доношенных и поздних недоношенных детей, рожденных самопроизвольно и путем операции кесарева сечения.

Материал и методы

Проведено проспективное исследование на когортах доношенных и поздних недоношенных новорожденных. Рандомизацию проводили блочным методом, в результате сформированы 4 группы: 1-я группа - 49 доношенных детей, родившихся путем самопроизвольных родов, срок гестации -38-41 нед; 2-я группа - 51 доношенный ребенок, родившийся путем операции кесарева сечения, срок гестации -38-41 нед; 3-я группа - 25 детей, родившихся путем самопроизвольных родов на 35-37-й неделях гестации; 4-я группа - 26 детей, родившихся путем операции кесарева сечения на 35-37-й неделях гестации.

В группу доношенных детей (n=100) отбирали новорожденных согласно следующим критериям: гестационный возраст - 38-41 нед; оценка по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах жизни - 8-9 баллов; масса тела - более 2800 г.

Критериями невключения были соматическая патология, хромосомные аномалии, инфекционные заболевания в перинатальном периоде.

Критерии исключения из исследования: отказ матери от участия в исследовании, необходимость использования пробиотиков. Для исключения инфекционной патологии или других факторов, способных повлиять на формирование микробиоты кишечника, всем доношенным новорожденным проведено клиническое исследование показателей крови и мочи. Девочек было 46, мальчиков 54. Большинство доношенных детей находились только на грудном вскармливании, часть детей докармливали искусственными смесями и только 4 (4,0%) ребенка были на искусственном вскармливании. У матерей доношенных новорожденных не отмечено длительного безводного промежутка [безводный промежуток от 8 до 16 ч наблюдался у 4 (4,1%) из 98 женщин]; истмико-цервикальная недостаточность отмечена у 3 (3,1%) женщин. Гестационным сахарным диабетом страдали 4 (4,1%) беременные, заболеваниями щитовидной железы - 11 (11,2%) женщин.

Недоношенных детей (n=51) отбирали согласно критериям включения в исследование: гестационный возраст - 35-37 нед; критериями невключения были соматическая патология, наличие каких-либо видимых пороков развития, хромосомных аномалий; критерии исключения: отказ матери от участия в исследовании. Девочек оказалось 25, мальчиков 26. В течение 1-й недели жизни получали антибиотики 11 (21,6%) детей. Грудное молоко отдельно или в сочетании с искусственными смесями получали 40 (78,4%) детей. Только на искусственном вскармливании находились 11 (21,6%) детей. Пробиотики (Бифидумбактерин и Лактобактерин) на фоне приема антибиотиков и искусственного либо смешанного вскармливания получали 37 (72,5%) детей. Безводный промежуток более 8 ч отмечен у 10 (25,6%) из 39 женщин, родивших недоношенных детей. Антибиотики во время беременности принимали 9 (23,1%) женщин, истмико-цервикальная недостаточность отмечена у 10 (25,6%) женщин, беременность на фоне вспомогательных репродуктивных технологий наступила у 9 (23,1%) женщин. Гестационным сахарным диабетом страдали 5 (12,8%) женщин, заболеваниями щитовидной железы - 9 (23,1%) женщин. В случае оперативного родоразрешения женщины получали амоксициллин/клавулановую кислоту до и во время операции.

У новорожденных проводили 3-кратный отбор проб фекалий: в 1-е сутки (меконий), в конце 1-й недели и в конце 1-го месяца жизни (кал). Образцы фекалий в течение 2 ч доставляли в микробиологическую лабораторию. Изучение состава микробиоты кишечника новорожденных проводили методом культуромики c использованием расширенного спектра селективных и неселективных питательных сред. Посев кала проводили на следующие питательные среды: колумбийский кровяной агар, хромогенную среду Brilliance, сальмонелла-шигелла-агар, декстрозный агар Сабуро (Oxoid, Великобритания), маннит-солевой агар (Himedia, Индия), среду для выявления и дифференциации Streptococcus agalactiae (CHROMagar, Франция), энтерококковый агар, агар Эндо (ФГУН ГНЦ ПМБ, Россия). Лактобациллы культивировали на среде лактобакагар (ФГУН ГНЦ ПМБ, Россия) в СО2-инкубаторе (Jouan, Франция) с концентрацией СО2 - 5%. Строгие анаэробы выделяли на агаре для бифидобактерий (Himedia, Индия), прередуцированном агаре Шедлера, основном агаре для анаэробов, перфрингенс-агаре, железосульфитном агаре, селективном агаре для Clostridium difficile (Oxoid, Великобритания) в анаэробном боксе (Whitley DG 250 Anaerobic Workstation, Великобритания) в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (N2 - 80%; CO2 - 10%; Н2 - 10%). Грибы культивировали на агаре Сабуро в термостате при 30 °С в течение 5 дней. Для посева мекония использовали следующие среды: колумбийский агар, хромогенную среду Brilliance, агар Сабуро, лактобакагар, агар Шедлера. Для контроля стерильности использовали тиогликолевый бульон (Oxoid, Великобритания).

Идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли методом MALDI-TOF MS с помощью масс-спектрометра AutoFlex III c программным обеспечением Maldi BioTyper (Bruker Daltoniks; Германия), версия 4.0. При получении значений SCORE ≥2,0 культуру считали с высокой вероятностью идентифицированной до вида. При значениях SCORE в диапазоне 1,7-1,9 культуру считали идентифицированной до рода. Для всех трудноидентифицируемых изолятов (при значении SCORE <2,0) проводили секвенирование участка гена 16S рРНК.

Изначально данные обрабатывались с помощью программного обеспечения на базе Python. Статистический анализ был выполнен с помощью программы Origin 2016 (OriginLab Corp.) и Microsoft Excel. Данные были представлены как медианы и интерквартильные расстояния. Выбросы здесь определялись как наблюдения, которые падают ниже Q1-1,5 IQR или выше Q3+1,5 IQR. На ящике диаграмм самое высокое и самое низкое значение в рамках этого предела обозначено усами прямоугольника. Различия между группами в зависимости от гестационного возраста и способа родоразрешения проверены с помощью критерия Манна-Уитни; p<0,05 считали значимым.

Результаты

Установлено, что в составе микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) новорожденных доминирующими микроорганизмами по частоте встречаемости и количественным характеристикам были представители 4 типов: Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria и Bacteroidetes (рис. 1). Редко и в низком титре встречались микроорганизмы типа Fusobacteria. Бактерии типа Firmicutes относились к 6 порядкам, 16 семействам, 18 родам и 98 видам. Тип Actinobacteria был представлен 8 порядками, 9 семействами, 12 родами и 35 видами. В составе типа Proteobacteria обнаружены бактерии 8 порядков, 14 семейств, 21 рода, 41 вида. Меньшее видовое разнообразие наблюдалось среди бактерий типа Bacteroidetes - 11 видов 1-го порядка, 3 семейств и 3 родов.

В первой временной точке меконий оказался стерильным примерно у каждого 3-го ребенка, рожденного естественным путем, почти у половины доношенных детей, рожденных путем операции кесарева сечения, и у 2/3 недоношенных, рожденных оперативным путем (у 30,6% детей 1-й группы, 47,1% - 2-й группы, 36,0% - 3-й группы и 73,1% - 4-й группы). Таким образом, обсемененными в большей степени оказались дети, рожденные в срок естественным путем. У детей с наличием роста микроорганизмов в меконии выделена разнообразная микробиота в минимальных количествах, не превышающих 102-103 КОЕ/г фекалий. Наиболее часто во всех группах выделяли коагулазонегативные стафилококки (CoNS), частота встречаемости которых составила 20,0-40,0%. Escherichia coli с наибольшей частотой встречалась в 1-й и 3-й группах новорожденных (18,4 и 16%). Во 2-й группе частота выделения этого микроорганизма была снижена в 2-3 раза (5,9%), а в 4-й группе - почти в 5 раз (3,8%). Частота высева прочих энтеробактерий находилась на том же уровне, что и E. coli, во всех группах, за исключением 4-й, в которой этот показатель был в 2 раза выше. Лактобациллы в основном встречались у детей, рожденных естественным путем (12,0-14,3%), и обычно были представлены Lactobacillus crispatus. Облигатные анаэробы (бифидобактерии и бактероиды) выделены в незначительном числе случаев, преимущественно у доношенных детей, рожденных естественным путем. Видовое разнообразие в группах доношенных детей оказалось примерно одинаковым: 35 и 40 видов в 1-й и 2-й группах. В 3-й группе этот показатель оказался меньше - лишь 18 видов, а у недоношенных детей, рожденных оперативным путем, был минимальным - 9 видов (см. таблицу).

Во второй временной точке (7-е сутки) значительно возросло видовое разнообразие и титры микроорганизмов во всех группах. Так, E. coli и прочие энтеробактерии встречались во всех группах с частотой 50,0-60,0% (рис. 2) в высоких титрах - 1010-1012 КОЕ/г. На 7-й день выявлено статистически значимое увеличение титра энтеробактерий во всех группах (рис. 3). Вместе с тем необходимо отметить, что при естественных родах у доношенных и недоношенных новорожденных была несколько выше представленность E. coli и, напротив, ниже - других условно-патогенных энтеробактерий. Грамположительные кокки (энтерококки, стрептококки и стафилококки) представлены во всех группах примерно на одном уровне, причем высеваемость стафилококков и энтерококков приблизилась к 100%. Частота встречаемости бифидобактерий выше в 1-й группе (67,0%), а в остальных группах она снижена почти вдвое - до 39; 36 и 34% соответственно (рис. 4). Титр бифидобактерий во всех группах был высоким и составил 1010-1012 КОЕ/г фекалий (рис. 5). Представленность бактероидов была максимальна в 1-й группе (34,7%), более чем в 2 раза (16,0%) снижена в 3-й группе, а у детей, рожденных оперативным путем, эти микроорганизмы отсутствовали (4-я группа) или встречались с минимальной частотой (3,9% - 2-я группа).

Значительно выросло по сравнению с первой временной точкой видовое разнообразие этой группы микроорганизмов (с 1 до 7 видов), а степень обсемененности была стабильно высокой во всех группах (1010-1012 КОЕ/г). В конце 1-й недели жизни впервые во всех группах с частотой 20,0-30,0% обнаружены представители 2 классов: Clostridia (Clostridium perfringens, C. sordellii, C. novyi, C. tertium, C. butyricum, Clostridioides difficile) и Erysipelotrichia (Erysipelatoclostridium ramosum и [Clostridium] innocuum) (рис. 6). Видовой состав лактобацилл расширился по сравнению с первой временной точкой и составил 17 видов. Обращает на себя внимание тот факт, что лактобациллы чаще обнаруживали у недоношенных детей (в 3-й группе - у 72,0%, в 4-й - у 58,0%), в то время как у доношенных детей частота их выявления не превышала 47,0%.

Однако необходимо отметить, что у недоношенных детей видовой состав лактобацилл представлен в основном такими видами, как Lactobacillus fermentum и L. plantarum, входящими в состав пробиотических препаратов. Во всех группах сравнения на 7-е сутки статистически значимо увеличился титр лактобацилл (рис. 7). Значительно выросло во всех группах видовое разнообразие, однако в обеих группах доношенных детей (1-я и 2-я группы) оно оказалось примерно на одном уровне - 88 и 85 видов соответственно. У недоношенных этот показатель существенно снижен, причем в большей степени у детей, рожденных оперативным путем, - 51 и 36 видов в 3-й и 4-й группах соответственно.

К концу 1-го месяца жизни возросла частота встречаемости энтеробактерий во всех группах: для энтеробактерий, отличных от E. coli, этот показатель оказался достоверно выше у детей, рожденных оперативным путем (80,0 против 65,0% у детей, рожденных естественным путем) (см. рис. 2), а для E. coli - у недоношенных детей (соответственно 80,0 и 92,3% против 75,5 и 74,5% у доношенных), причем у детей 4-й группы достоверно выше. Титр этих групп микроорганизмов остался высоким - 1010-1012 КОЕ/г (см. рис. 3). Во всех группах детей частота обнаружения энтерококков и стафилококков осталась близкой к уровню 1-й недели, а титр несколько снизился. В обеих группах недоношенных детей выросла колонизация кишечника стрептококками (до 52,0 и 38,0% соответственно в 3-й и 4-й группах). Представленность бифидобактерий увеличилась в 3-й группе до уровня 1-й группы; вo 2-й группе также выросла по сравнению с 1-й неделей, но не достигла уровня 1-й группы, а в 4-й осталась без изменений (см. рис. 4). Титр бифидобактерий оставался во всех группах стабильно высоким - 1010-1012 КОЕ/г (см. рис. 5). Таким образом, в течение 1-го месяца в 1-й группе по степени обсемененности бифидобактериями достоверная разница обнаружена между всеми тремя временными точками, во 2-й группе достоверно различались лишь временные точки - 7 и 30 дней. В 3-й и 4-й группах не наблюдалось разницы в титрах бифидобактерий временных точек 2 и 3 (см. рис. 5). К концу 1-го месяца жизни в 3-й группе резко возросла частота выделения бактероидов, достигнув уровня 1-й группы (40,0%), а в 4-й группе они появились впервые, но с низкой частотой (7,7%).

В группах доношенных детей высеваемость бактероидов осталась на уровне 1-й недели (в 1-й группе - 39,0%, во 2-й - 6,0%). Частота встречаемости и степень обсемененности фекалий бактериями классов Clostridia и Erysipelotrichia увеличились во всех группах, но наибольшего роста эти показатели достигли на 30-й день в группах детей, рожденных оперативным путем (56,9 и 61,5% соответственно во 2-й и 4-й группах). В группах детей, рожденных естественным путем, эти микроорганизмы выделяли со значительно меньшей частотой: 35,0% в 1-й группе и 40,0% в 3-й. Таким образом, в течение 1-го месяца наблюдения была показана тенденция к увеличению титров этих микроорганизмов на 7-й и 30-й дни жизни и отсутствие титра на первые сутки у всех групп сравнения (см. рис. 6).

Результаты исследования представлены в таблице.

Учитывая, что к концу 1-го месяца жизни микробиота ЖКТ новорожденных детей претерпела наибольшие изменения, мы выбрали этот временной отрезок для оценки влияния способа родоразрешения на ее становление. Результаты сравнительного исследования микробиоты ЖКТ недоношенных и доношенных детей 1-го месяца жизни в зависимости от характера родоразрешения представлены на тепловых картах (рис. 8 и 9). Каждая горизонтальная линия отражает видовой состав микробиоты одного ребенка, а цветовая гамма указывает на титр отдельных микроорганизмов в соответствии со шкалой справа. Сопоставление микробиоты недоношенных детей (см. рис. 8) показало, что в группе детей, рожденных естественным путем (3-й группа), отмечено большее видовое разнообразие в сравнении с детьми, рожденными путем операции кесарева сечения (4-я группа), - 69 и 52 вида соответственно.

Среди факультативных анаэробов не выявлено существенной разницы в частоте выделения наиболее часто встречающихся групп микроорганизмов в 3-й и 4-й группах: CoNS (96,0 и 96,2% соответственно), Enterococcus faecalis (92,0 и 92,3%) и E. coli (84,0 и 92,3%), но наблюдалась более частая колонизация ЖКТ S. aureus (48,0 и 61,5%) и прочими энтеробактериями (64,0 и 80,8%) у детей 4-й группы. Облигатно-анаэробные микроорганизмы из группы комменсалов чаще выделяли у детей 3-й группы. Так, бифидобактерии с большей частотой (68,0 и 34,6%) и большим видовым разнообразием (7 и 4 видов соответственно) встречались у детей 3-й группы, преимущественно за счет 2 видов: B. longum (48,0 и 7,6%) и B. breve (28,0 и 15,4%). Лактобациллы также чаще (72,0 и 57,7%) и с более широким видовым спектром (10 и 7 видов) обнаруживали у детей 3-й группы, преимущественно за счет 2 видов L. paracasei (16,0 и 3,8%) и L. reuteri (24,0 и 0%). Только во 2-й группе была отмечена тенденция к увеличению титра на 30-е сутки, в остальных случаях было показано количественное снижение. Увеличилась высеваемость лактобацилл в группах доношенных детей с 49% в конце 1-й недели до уровня 60% к концу 1-го месяца жизни. В группах недоношенных детей она осталась на прежнем высоком уровне, что может объясняться введением в схему лечения пробиотиков. Титр лактобацилл не изменился по сравнению со 2-й временной точкой (см. рис. 7).

Бактероиды значительно чаще колонизировали ЖКТ детей 3-й группы (40,0 и 7,7%) при значительно большем видовом разнообразии (6 и 1 вид). Доминирующим в обеих группах был вид Bacteroides vulgatus (20,0 и 7,6%). Бактерии классов Clostridia и Erysipelotrichia, напротив, чаще выделяли у детей, рожденных оперативным путем, в сравнении с недоношенными, рожденными естественным путем (61,5 и 40,0%), преимущественно 2 видов: С. perfringens (57,7 и 28,0%) и C. innocuum (11,5 и 0%).

Сравнение состава микробиоты доношенных детей (см. рис. 9) показало, что по количеству выделенных видов микроорганизмов дети, рожденные естественным путем (1-я группа), и путем операции кесарева сечения (2-я группа), практически не отличались: 97 и 99 видов соответственно. Так же как и у недоношенных детей, среди факультативных анаэробов в сравниваемых группах доношенных детей не выявлено значимой разницы частоты выделения CoNS (95,9 и 96,1% соответственно), Enterococcus faecalis (85,7 и 98,0% соответственно) и E. coli (75,5 и 74,5%), но наблюдалась более частая колонизация S. aureus (55,1 и 76,5%) и энтеробактериями, отличными от E. сoli (65,3 и 80,4%), у детей 2-й группы. Бифидобактерии с большей частотой (65,3 и 47,1%) и близким по составу видовым спектром (7 и 6 видов соответственно) встречались у детей 1-й группы, преимущественно за счет вида B. longum (48,9 и 25,5%). Лактобациллы обнаруживали практически с одинаковой частотой (59,2 и 62,7%) и широким видовым спектром (15 и 12 видов) в обеих группах. Бактероиды, так же как у недоношенных детей, значительно чаще колонизировали ЖКТ детей, рожденных естественным путем (38,8 и 5,9%), при большем видовом разнообразии (7 и 3 вида) и доминировании B. fragilis (18,4 и 0%) и B. thetaiotaomicron (14,3 и 0%). Бактерии классов Clostridia и Erysipelotrichia, напротив, чаще выделяли у детей, рожденных оперативным путем, в сравнении с доношенными, рожденными естественным путем (56,9 и 34,7% соответственно), преимущественно 2 видов: С. perfringens (43,1 и 30,6%) и C. tertium (11,8 и 2,0%).

Обсуждение

Развитие ЖКТ плода в процессе гестации проходит стадии дифференцировки клеток, становления ферментативного расщепления, всасывания и перистальтики [1]. Анатомически все части ЖКТ закладываются в течение первых 12 нед гестации. Пили и крипты формируются до 20-й недели. Недоношенные новорожденные страдают от незрелости процессов ферментативного расщепления и перистальтики, поскольку эти функции устанавливаются на поздних сроках гестации. Ферменты (например, лактаза, сахараза, мальтаза, пептидаза) определяются у плода уже с 8-й недели гестации, но некоторые ферменты на этой стадии развития далеки от нормы по концентрации и активности. Лактазная активность выявляется с 24-й недели и достигает максимума в 40 нед гестации. Максимальная активность лактазы внутриутробно составляет только 30,0% ферментативной активности взрослого человека и запускается при первом кормлении. Сосание, глотание, опорожнение и перистальтика кишечника формируются в III триместре беременности, а их эффективная координация возможна только у доношенных детей. Кроме того, недоношенные дети со сроком гестации <32 нед не толерантны к энтеральному вскармливанию, и большинство питательных веществ ребенок получает внутривенно в течение нескольких недель. Дефицит питательных веществ ассоциирован с незрелостью эндокринной и ферментативной систем, замедленным созреванием слизистой кишечника, недостаточностью процессов всасывания питательных веществ и перистальтики, повышенной проницаемостью кишечника и бактериальной транслокацией. Поэтому для стимуляции функционального созревания ЖКТ недоношенных практикуют минимальное энтеральное питание.

Недоношенные дети подвержены влиянию большого числа факторов эндогенного и экзогенного порядка, сказывающихся на формировании микробиоты кишечного биотопа [2]. Помимо необходимости проведения операции кесарева сечения, а значит отсутствия контакта с микрофлорой матери при рождении, недоношенные дети гораздо чаще требуют применения антибиотиков, пробиотиков, длительного пребывания в условиях госпитальной среды, иногда приходится отложить начало энтерального питания (влияние данных факторов выходит за рамки настоящей работы). Все это не может не сказаться на показателях качественного и количественного состава микрофлоры ЖКТ. Кроме того, организм недоношенного ребенка отличается незрелостью иммунной регуляции и функционирования кишечного барьера, что модулирует адгезию и микробную колонизацию.

Важным фактором является то, что состав кишечной микробиоты матери нестабилен и значительно меняется на протяжении всей беременности [3]. Поэтому исходный колонизирующий инокулюм, получаемый ребенком от матери, определяется сроком беременности на момент родов (влияние данного фактора на микрофлору кишечника новорожденнного не входит в рамки настоящей работы). В то же время ряд авторов [4, 5] утверждают, что состав микробиоты в большей степени зависит от постменструального возраста, включающего гестационный и постнатальный возраст

(на момент исследования), проходя 4 стадии: доминирования стафилококков на 25-30-й неделях постменструального возраста, энтерококков на 30-й неделе постменструального возраста (обе стадии заканчиваются к 35-й неделе), энтеробактерий на 35-й неделе. Доминирование бифидобактерий начинается после 30-й недели, что является индикатором здоровой микрофлоры. R.D. Zwittink [1] также показал, что бифидобактерии колонизируют кишечник недоношенных между 35-й и 38-й неделями постменструального возраста независимо от постнатального возраста.

Наше исследование включало доношенных и поздних недоношенных детей, поэтому мы могли наблюдать становление микробиоты, начиная с 3-й стадии - доминирования энтеробактерий. Полученные нами данные не противоречат этому заключению: меконий поздних недоношенных детей был колонизирован E. coli и другими энтеробактериями на уровне доношенных детей, рожденных путем операции кесарева сечения. На протяжении 1 мес наблюдения их количество продолжало нарастать одновременно с ростом количества бифидобактерий с отставанием от доношенных детей, рожденных естественным путем, но к 1-му месяцу жизни достигало их уровня в 3-й группе [6, 7].

Кроме того, композиционный состав микробиоты кишечника зависит от способа родоразрешения, что показано в нашем более раннем исследовании [8]. По данным Е.С. Gritz и V. Bhandari [9], новорожденные после естественных родов колонизируются вагинальной микрофлорой матери (лактобациллами, превотеллами), а после операции кесарева сечения - микрофлорой кожи (клостридиями, стафилококками, пропионибактериями, коринебактериями), что приводит к дефициту строгих анаэробов - бактероидов и бифидобактерий [10-14]. Н.Е. Jakobsson и соавт. [15] показали, что у доношенных детей, рожденных оперативным путем, после операции кесарева сечения наблюдается нехватка или замедленная колонизация бактероидами, вплоть до 1 года жизни при минимальном видовом разнообразии. Другие исследователи установили, что различия в составе микробиоты ЖКТ детей, рожденных естественным путем и посредством оперативного родоразрешения, могут сохраняться до 7 лет [16].

Полученные нами результаты согласуются с исследованиями других авторов [4, 5, 17, 18]. Способ родоразрешения и гестационный возраст влияют на первичную колонизацию кишечника, создавая предпосылки для дальнейшего становления микрофлоры ЖКТ. Дети, рожденные естественным путем, уже на этом этапе имеют преимущества, поскольку их биотопы заселяются главным образом микрофлорой матери, имеющей в своем составе полезные лактобациллы, бифидобактерии и бактероиды, в отличие от детей, рожденных путем операции кесарева сечения и колонизирующихся микрофлорой окружающей среды.

К концу 1-й недели жизни у детей всех групп в составе кишечной микробиоты начинают превалировать строгие анаэробы над факультативно-анаэробной составляющей, но у недоношенных детей и доношенных, рожденных оперативным путем, этот процесс идет гораздо медленнее. Несмотря на возросшее во всех группах видовое разнообразие микроорганизмов, ЖКТ детей, рожденных оперативным путем, в большей степени заселяется условно-патогенной микрофлорой (энтеробактериями, отличными от E.coli, и клостридиями) и в меньшей степени полезными бактериями. Этот процесс несколько сглаживается благодаря коррекции дисбиоза у недоношенных детей с помощью пробиотических препаратов.

К концу 1-го месяца жизни сохранялось существенное различие в показателях качественного и количественного состава микробиоты ЖКТ у детей сравниваемых групп. Вместе с тем недоношенные дети, рожденные естественным путем, по частоте встречаемости и уровню колонизации бифидобактериями и бактероидами приблизились к показателям доношенных детей, рожденных естественным путем. Высокий уровень лактобацилл (в основном L. fermentum и L.plantarum) у недоношенных детей свидетельствует об эффективности своевременной коррекции дисбиоза с помощью пробиотиков. По такому показателю, как заселение ЖКТ бактероидами, которые не входят в состав используемых для коррекции микробиоты пробиотических препаратов, дети, рожденные оперативным путем, более чем в 5 раз отставали от детей, рожденных путем самопроизвольных родов. На фоне сниженных показателей колонизации бифидобактериями у доношенных и недоношенных детей, рожденных оперативным путем, возрастает риск колонизации ЖКТ факультативно-анаэробными условно-патогенными микроорганизмами (энтеробактериями, отличными от E.coli, и S. aureus), а также облигатно-анаэробными условно-патогенными микроорганизмами классов Clostridia и Erysipelotrichia.

Заключение

Проведенный анализ позволяет говорить о том, что наиболее значимым фактором, влияющим на колонизационные процессы, является гестационный возраст. Кесарево сечение, исключающее естественную колонизацию материнской микрофлорой, в значительной степени сдерживает процесс нормального становления кишечной микробиоты. По такому показателю, как заселение ЖКТ бактероидами, дети, рожденные оперативным путем, отставали от детей, рожденных естественным путем. Поэтому, по нашему мнению, включение в схему лечения таких детей пробиотиков является оправданным шагом, тем более если это касается недоношенных новорожденных.

Этика. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом. Информированное согласие законных представителей новорожденных детей на участие в исследовании получено до начала исследования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Zwittink R.D. Gastrointestinal function and microbiota development in preterm infants. PhD Thesis. Netherlands, 2018. 164 p. DOI: https://doi.org/10.18174/445530

2. Forsgren M., Isolauri E., Salminen S., Rautava S. Late preterm birth has direct and indirect effects on infant gut microbiota development during the first six months of life // Acta Paediatrica. 2017. Vol. 106, N 7. P. 1103-1109. DOI: https://doi: 10.1111/apa.13837

3. Koren O., Goodrich J.K., Cullender T.C., Spor A., Laitinen K., Bäckhed H.K. et al. Host remodeling of the gut microbiome and metabolic changes during pregnancy // Cell. 2012. Vol. 3. P. 470-480. DOI: https://doi: 10.1016/j.cell.2012.07.008

4. Itani T., Moubareck C.A., Melki I. et al. Establishment and development of the intestinal microbiota of preterm infants in a Lebanese tertiary hospita //. Anaerobe. 2017. Vol. 43. P. 4-14. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2016.11.001

5. Korpela K., Blakstad E.W., Moltu S.J. et al. Intestinal microbiota development and gestational age in preterm neonates // Scientific Reports. 2018. Vol. 8. P. 2453. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-018-20827-x

6. Wang Y., Hoenig J.D., Malin K.J. et al. 16S rRNA gene-based analysis of fecal microbiota from preterm infants with and without necrotizing enterocolitis // ISME J. 2009. Vol. 3. P. 944-954. DOI: https://doi.org/10.1038/ismej.2009.37

7. Mai V., Torrazza R.M., Ukhanova M. et al. Distortions in development of intestinal microbiota associated with late onset sepsis in preterm infants // PLoS ONE. 2013. Vol. 8, N 1. P. e52876. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052876

8. Припутневич Т.В. Исаева Е.Л., Муравьева В.В. и др. Микробиота кишечника здоровых новорожденных детей: новые технологии диагностики - новый взгляд на процесс становления // Вестник РГМУ, 2019. № 5. С. 109-114. DOI: https://doi.org/10.24075/vrgmu.2019.063

9. Gritz E.C., Bhandari V. The human neonatal gut microbiome: a brief review // Front. Pediatr. 2015. Vol. 3. P. 17. DOI: https://doi.org/10.3389/fped.2015.00017.eCollection 2015

10. Madan J.C., Farzan S.F., Hibberd P.L., Karagas M.R. Normal neonatal microbiome variation in relation to environmental factors, infection and allergy // Curr. Opin. Pediatr, 2012. Vol. 24. P. 753-759. DOI: https://doi.org/10.1097/MOP.0b013e32835a1ac8

11. Di Mauro A., Neu J., Riezzo G. et al. Gastrointestinal function development and microbiota // Ital. J. Pediatr. 2013. Vol. 39. P. 15. DOI: https://doi.org/10.1186/1824-7288-39-15

12. Torrazza R.M., Neu J. The altered gut microbiome and necrotizing enterocolitis // Clin. Perinatol. 2013. Vol. 40. P. 93-108. DOI: https://doi:10.1016/j.clp.2012.12.009

13. Scholtens P.A., Oozeer R., Martin R. et al. The early settlers: intestinal microbiology in early life // Annu Rev. Food Sci Technol. 2012. Vol. 3. P. 425-447. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-food-022811-101120

14. Biasucci G., Rubini M., Riboni S. et al. Mode of delivery affects the bacterial community in the newborn gut // Early Hum. Dev. 2010. Vol. 86, S1. P. 13-15. DOI: https://doi.org/10.1016/j.earlhumdev.2010.01.004

15. Jakobsson H.E., Abrahamsson T.R., Jenmalm M.C. et al. Decreased gut microbiota diversity, delayed Bacteroidetes colonisation and reduced Th1 responses in infants delivered by caesarean section // Gut. 2014. Vol. 63. P. 559-566. DOI: https://doi.org/10.1136/gutjnl-2012-303249

16. Salminen S., Gibson G.R., McCartney A.L., Isolauri E. Influence of mode of delivery on gut microbiota composition in seven year old children // Gut, 2004. Vol. 53. P. 1388-1389. DOI: https://doi.org/10.1136/gut.2004.041640

17. Cox L.M., Yamanishi S., Sohn J. et al. Altering the intestinal microbiota during a critical developmental window has lasting metabolic consequences // Cell. 2014. Vol. 158. P. 705-721. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.05.052

18. Schulfer A., Blaser M.J. Risks of antibiotic exposures early in life on the developing microbiome // PLoS Pathog. 2015. Vol. 11. P. e1004903. DOI: https://doi.org/10.1371/ journal.ppat.1004903

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Дегтярев Дмитрий Николаевич
Доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, заведующий кафедрой неонатологии Клинического института детского здоровья имени Н.Ф. Филатова ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет), председатель Этического комитета Российского общества неонатологов, Москва, Российская Федерация

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»