Анализ уровней TREС и KREC у недоношенных новорожденных с учетом гестационного возраста, хориальности, специфических осложнений антенатального периода и наличия инфекционно-воспалительных заболеваний в раннем неонатальном периоде

• Павличенко Мария Васильевна
• Косовцова Наталья Владимировна
• Чумарная Татьяна Владиславовна
• Черемохин Дмитрий Андреевич
• Болков Михаил Артемович
• Соловьева Ольга Эдуардовна

Резюме

Высокие показатели перинатальной заболеваемости и смертности при осложненном течении многоплодной беременности обусловливают важность дальнейшего поиска маркеров неблагоприятных исходов.

Цель исследования - изучить содержание молекул TREC и KREC у недоношенных новорожденных с учетом гестационного возраста, хориальности, специфических осложнений антенатального периода (фето-фетального трансфузионного синдрома, селективной задержки роста плода), наличия инфекционно-воспалительных заболеваний у беременных и новорожденных, показателей общего анализа крови и других маркеров инфекционно-воспалительных заболеваний на 7-е сутки жизни.

Материал и методы. Проведено одноцентровое поперечное (одномоментное) исследование недоношенных детей в возрасте 7 сут жизни (144-168 ч жизни) на базе ФГБУ "НИИ ОММ" Минздрава России (Екатеринбург) с 01.01.2023 по 20.12.2023. Всем детям проводили иммунологический скрининг с количественным определением ДНК TREC и KREC методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Использовали набор реагентов "Иммуно-БиТ" ("АБВ-тест", Россия). В исследование вошли 435 недоношенных новорожденных гестационного возраста (ГВ) 25/0-36/6 нед. Основную группу составили 120 монохориальных близнецов (n=120). Группа сравнения (n=315) представлена новорожденными от одноплодных беременностей (n=247) и дихориальными близнецами (n=68). Пациенты основной группы разделены в зависимости от осложнений антенатального периода: новорожденные, перенесшие фето-фетальный трансфузионный синдром (n=30; 15 пар); новорожденные с синдромом селективной задержки роста плода (n=40; 20 пар) и новорожденные с отсутствием указанных осложнений внутриутробного развития (n=50; 25 пар). Статистическая обработка материала выполнена в SPSS 27.0 с использованием непараметрических критериев. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты. У недоношенных новорожденных ГВ 25/0-31/6 нед выявлены достоверно низкие уровни TREC, что свидетельствует об угнетении Т-клеточного иммунитета (р<0,0001). У дихориальных недоношенных близнецов 25/0-36/6 нед ГВ наблюдалось статистически значимое повышение количества KREC, что характерно для активации В-клеточного иммунитета (p<0,05). При осложненном течении монохориального многоплодия диагностированы особенности иммунитета: после перенесенного фето-фетального трансфузионного синдрома - снижение ДНК TREC (p=0,039), а на фоне селективной задержки роста плода - повышение уровня KREC (p=0,032). Определена обратная корреляционная зависимость между заболеванием беременной инфекцией мочевых путей с бактериурией и содержанием KREC у монохориальных близнецов (r= -0,267; p=0,003).

Выявлена отрицательная корреляционная связь между количеством молекул TREC и KREC у монохориальных близнецов на 7-е сутки жизни, наличием различных инфекционно-воспалительных заболеваний в раннем неонатальном периоде и содержанием сегментоядерных нейтрофилов (%, абс.), а также положительная корреляция между уровнями TREC и количеством лимфоцитов (%, абс.).

Заключение. Уровень TREC у монохориальных близнецов зависит от гестационного возраста и наличия специфических осложнений антенатального периода (фето-фетального трансфузионного синдрома и селективной задержки роста плода), что необходимо учитывать при интерпретации результатов расширенного неонатального скрининга.

Ключевые слова: монохориальные диамниотические двойни; TREC; KREC; фето-фетальный трансфузионный синдром; селективная задержка роста плода; "Иммуно-БиТ"

Частота наступления многоплодной беременности в настоящее время не имеет тенденции к снижению и варьирует от 3 до 40 случаев на 1000 родов в зависимости от региона мира [1, 2]. Показатель материнской смертности при многоплодной беременности в 2,5 раза выше, а перинатальные осложнения в 9-11 раз превышают аналогичные при одноплодной беременности [3, 4].

В зависимости от типа хориальности и количества амниотических полостей выделяют дихориальные диамниотические (2 плаценты и 2 амниона), монохориальные диамниотические (единая плацента и 2 амниона) и монохориальные моноамниотические варианты (оба плода имеют одну плаценту и находятся в одном амнионе, 1% среди всех монозиготных двоен) [5, 6]. Для снижения частоты перинатальных осложнений разработаны алгоритмы ведения беременных с многоплодием [4, 7, 8].

Особого внимания заслуживает монохориальный тип плацентации: примерно в 30% случаев возможны опасные для здоровья беременной и ее близнецов осложнения, в том числе преждевременные роды [9-11]. Основными специфическими осложнениями при многоплодной беременности являются фето-фетальный трансфузионный синдром (ФФТС), формирование селективной задержки роста плода (СЗРП), синдром обратной артериальной перфузии (СОАП), синдром анемии-полицитемии (САП) и их комбинации. Сочетание недоношенности с указанными неблагоприятными факторами антенатального периода, связанными с функционированием единой плаценты, осложняет не только перинатальный период, но может иметь и отдаленные отрицательные последствия на состояние здоровья монохориальных близнецов [12, 13].

Супрессорная направленность иммунных реакций у недоношенных новорожденных ориентирована на предупреждение развития тяжелых иммунопатологических реакций в результате контакта с большим количеством антигенов окружающей среды [14]. Известно, что мобилизация факторов врожденного и адаптивного иммунитета у недоношенных детей подчинена общим закономерностям процесса адаптации, однако влияние различных патологических состояний антенатального периода на функционирование иммунной системы недоношенного в постнатальном периоде остается недостаточно изученным [15, 16]. Установлено, что развитие всех внутренних органов и систем организма, в том числе иммунной системы, происходит в соответствии с гестационным периодом [17, 18]. Тимус и костный мозг - важные органы иммунной системы детей, ответственные за выработку функциональных Т- и В-клеток, являющихся важными компонентами адаптивной иммунной системы. В качестве суррогатных маркеров созревания Т- и В-клеток можно исследовать абсолютные значения эксцизионных колец Т-клеточного рецептора (T-cell Receptor Excision Circle, TREC) и κ-делеционного элемента (Kappa-deleting Recombination Excision Circle, KREC) В-клеток, методом полимеразной цепной реакции (в режиме реального времени (ПЦР РВ) [19, 20]. Учитывая факт стабильности количества TREC и KREC, определение числа молекул TREC и KREC широко используется у пациентов всех возрастных групп не только для диагностики первичных иммунодефицитных состояний (ПИД), но и для выявления особенностей при различных физиологических и патологических состояниях в группах онкологических и гематологических больных, а также при инфекционных заболеваниях (ВИЧ, SARS-CoV‑2, туберкулез, сепсис) [21-23].

Учитывая, что количественная оценка уровней TREC и KREC с 01.01.2023 используется для обследования новорожденных на территории РФ [24] и уже показала свою востребованность [25, 26] и эффективность [27, 28] в системе неонатального скрининга, мы рассмотрели возможность применения данного метода в группе монохориальных близнецов для поиска возможной зависимости содержанием молекул ДНК TREC и KREC от специфических осложнений внутриутробного периода и особенностей течения неонатального периода.

В научных публикациях отсутствует детальная оценка уровней молекул TREC и KREC у монохориальных близнецов. Учитывая актуальность поиска значимых маркеров неблагоприятных перинатальных исходов при многоплодной беременности, целью данного исследования было изучение содержания молекул TREC и KREC у недоношенных новорожденных с учетом гестационного возраста (ГВ), хориальности, специфических осложнений антенатального периода (ФФТС, СЗРП), наличия инфекционно-воспалительных заболеваний у беременных и новорожденных, показателей общего анализа крови и других маркеров инфекционно-воспалительных заболеваний на 7-е сутки жизни.

Материал и методы

Исследована общая группа недоношенных детей (n=435), рожденных в ФГБУ "НИИ ОММ" Минздрава России (Екатеринбург) с 01.01.2023 по 20.12.2023, ГВ которых составил 25/0-36/6 нед (рис. 1). В поперечном (одномоментном) исследовании участвовали 435 недоношенных новорожденных ГВ 25/0-36/6 нед. Основную группу составили 120 монохориальных близнецов (n=120). Группа сравнения (n=315) представлена новорожденными от одноплодных беременностей (n=247) и дихориальными близнецами (n=68). Пациенты основной группы были разделены в зависимости от осложнений антенатального периода: новорожденные, перенесшие ФФТС (n=30; 15 пар), с СЗРП (n=40; 20 пар) и с отсутствием указанных осложнений внутриутробного развития (n=50; 25 пар). Паспортный возраст рожениц наблюдаемых новорожденных составил 31 [26; 29] год, достоверных различий в этой категории между наблюдаемыми группами не выявлено.

Для определения возможной зависимости уровней TREC и KREC у недоношенных детей от ГВ выделено 4 группы: дети с экстремальной степенью недоношенности (ГВ - 25/0-27/6 нед), с тяжелой степенью недоношенности (ГВ - 28/0-31/6 нед), со средней и легкой степенью недоношенности (ГВ - 32/0-33/6 и 34/0-36/6 нед соответственно).

Для изучения возможной зависимости показателей TREC и KREC от типа хориальности мы разделили недоношенных младенцев на следующие группы: монохориальный тип плацентации отмечен у недоношенных, рожденных от одноплодных беременностей (n=247), и монохориальных близнецов (n=120); дихориальный тип плацентации - в группе дихориальных близнецов (n=68).

Для оценки возможного влияния инфекционно-воспалительных заболеваний, перенесенных наблюдаемыми беременными и монохориальными близнецами в перинатальном периоде, были проанализированы возможные различия в содержании маркеров наивных иммунокомпетентных клеток в зависимости от влияния указанных факторов. Рассмотрены следующие инфекционно-воспалительные заболевания у женщин в периоде беременности: острые респираторные инфекции, хронические цервико-вагинальные инфекции, инфекции мочевых путей. Кроме того, анализировали следующие клинические проявления инфекционно-воспалительных заболеваний и признаки инфекционного токсикоза у монохориальных близнецов: диспептические расстройства, дыхательные, гемодинамические нарушения, гепатоспленомегалия, патологическая желтуха и др., которые были подтверждены необходимыми лабораторно-инструментальными методами обследованиями.

При поступлении в отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных всем недоношенным монохориальным близнецам выполняли первичное микробиологическое обследование, включающее посев крови на стерильность и посевы со слизистой ануса. При изучении результатов показателей общего анализа крови в возрасте 7 сут жизни наблюдаемые монохориальные близнецы были разделены на 2 группы в зависимости от наличия инфекционно-воспалительных заболеваний в раннем неонатальном периоде (n=60 с проявлениями инфекционно-воспалительных заболеваний; n=60 - без проявлений).

Обследование и лечение новорожденных проводили согласно порядку оказания медицинской помощи по профилю "Неонатология", установленному приказом Минздрава России № 921н от 15.11.2012, а также в соответствии со ст. 76 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан Российской Федерации", клиническими рекомендациями по неонатологии. Анализ исследуемых параметров, клинических данных и медицинской документации (медицинские карты стационарного больного, форма № 003/у, беременной, форма № 096/у, история развития новорожденного, форма № 097/у, индивидуальная карта беременной и родильницы, форма № 111/у) проведен у 120 (60 пар) недоношенных монохориальных близнецов ГВ 25/0-36/6 нед.

Критериями невключения в исследование были:

· новорожденные от женщин с тяжелой экстрагенитальной патологией беременной;

· новорожденные от женщин с тяжелой преэклампсией, эклампсией, НЕLLP-синдромом;

· новорожденные от женщин с инфекцией В‑20, гепатитом В и С;

· новорожденные с подтвержденными врожденными пороками развития у одного или у обоих плодов.

В качестве биологического материала для молекулярно-генетических исследований количества молекул ДНК TREC и KREC использовали высушенные пятна капиллярной крови. Сухие пятна крови, использованные в настоящей работе, были собраны на 7-е сутки (в возрасте 144-168 ч жизни) после рождения из пятки недоношенных новорожденных из монохориальных двоен на фильтры Perkin Elmer 226 Guthrie cards (Perkin Elmer Health Sciences, США). Гатри-карты до использования хранили при комнатной температуре в лаборатории неонатального скрининга ГАУЗ СО КДЦ "ОЗМР" (Екатеринбург).

Количественное определение TREC и KREC было проведено с помощью отечественной тест-системы "Иммуно-БиТ" ("АБВ"-тест, Россия). Мультиплексную ПЦР РВ проводили в термоциклерах с оптическим блоком CFX96 (Bio-Rad, США) и LightCycler (Roche, Германия). Объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал в состав реакционного буфера готовую ПЦР-смесь, Taq-ДНК полимеразу и ДНК, выделенную из образцов сухой крови. ПЦР-смесь включала в себя праймеры и realtime-зонды для TREC, KREC и гена альбумина, который использовался в качестве внутреннего контрольного образца, раствор дезоксинуклеотидов. Этапы амплификации программировали в соответствии с инструкцией производителя. Для расчета концентрации использовали калибровочные кривые, полученные при проведении ПЦР из стандартов, входящих в состав набора, с концентрацией каждого аналита 1,3×10⁷, 4×10⁵, 5×10³ и 10³ копий в 1 мл.

При исследовании ДНК, выделенной из образцов крови, количество копий TREC/KREC в образце рассчитывали на 10⁵ ядросодержащих клеток (лейкоцитов) с учетом внутреннего контроля гена альбумина, по формуле [30, 31]:

Для анализа уровней и корреляционных связей абсолютных значений молекул ДНК TREC и KREC использовали данные клинических наблюдений внутриутробного развития и постнатального периода, а также результаты лабораторных исследований в возрасте 7 сут жизни. Материалом для исследования клинического анализа крови на 7-е сутки жизни служили образцы венозной крови, взятие осуществляли из интактной периферической вены, исследование проводили общепринятым методом на гематологическом автоматическом анализаторе АВХ Micros 60-ОТ18 (Франция).

Статистический анализ проведен с помощью программы SPSS 27.0 (IBM, США). Проверку нормального распределения величин проводили с использованием теста Шапиро-Уилка. Большинство рассматриваемых величин имело распределение, отличное от нормального. Для количественных данных результаты представлены в виде медианы (Me) и межквартильного размаха [25-й; 75-й перцентиль]. Сравнение 3 независимых групп и более проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением с поправкой на множественные сравнения. Сравнение 2 независимых групп проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, 2 зависимых групп - с помощью критерия Вилкоксона. Корреляционную зависимость оценивали с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена с поправкой на множественные сравнения.

Для качественных переменных представлено абсолютное значение и процент, сравнение проводили с помощью критерия χ² и точного критерия Фишера, при множественном сравнении использовали поправку Бонферрони.

Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.

Размер выборки предварительно не рассчитывали.

Этика. Проведенное исследование соответствует стандартам Хельсинкской декларации, одобрено независимым этическим комитетом ФГБУ "НИИ ОММ" Минздрава России (Екатеринбург, Россия), протокол № 13 от 12.10.2020. Все вошедшие в исследование подписали письменное информированное добровольное согласие.

Результаты

Для определения возможной зависимости количества молекул TREC и KREC от ГВ, провели статистический анализ с учетом указанного признака (табл. 1).

Выявлена статистически значимая зависимость между количеством молекул TREC и ГВ: четко прослеживается (р<0,0001) увеличение содержания молекул TREC у недоношенных новорожденных ГВ с 25/0 до 31/6 нед, далее статистически значимых отличий не выявлено. Значения показателей KREC в возрастных группах ГВ 25/0-36/6 нед статистически не различались (р>0,05). Содержание молекул KREC в сухих образцах крови всех недоношенных новорожденных ГВ 25/0-36/6 нед составило 1833,0 [1127,0-2947,0] копий KREC на 10⁵ лейкоцитов.

Показатели возможной зависимости показателей TREC и KREC от типа хориальности представлены в табл. 2.

Изучение содержания молекул TREC в образцах сухой крови недоношенных по выделенным группам не выявило статистически значимых различий (р>0,05). При этом анализ полученных данных по количественному показателю молекул KREC позволил нам выявить достоверные различия: уровень KREC в группе дихориальных диамниотических близнецов был статистически значимо выше по сравнению с недоношенными от одноплодных беременностей (р=0,029) и группой монохориальных близнецов (р=0,012), что может свидетельствовать о более активном созревании В-клеток в костном мозге у недоношенных новорожденных при дихориальном типе плацентации.

Общая характеристика пациентов основной группы с учетом ГВ, медианы значений ТRЕC и КRЕC представлена на рис. 2.

Анализ содержания молекул ТRЕC и КRЕC в образцах сухой крови мальчиков и девочек не выявил статистически значимых различий (р>0,05), что соответствует результатам, полученным другими исследователями в группе новорож­денных от одноплодных беременностей [32, 33]. Также были изучены количественные показатели молекул TREC и KREC в каждой паре между монохориальными близнецами, в зависимости от параметров физического развития (массы и длины тела) и очередности рождения - достоверных различий не выявлено (р>0,05). Таким образом, пациенты основной группы в дальнейшем не разделялись по указанным признакам. В результате поиска корреляционных зависимостей TREC и KREC монохориальных близнецов от паспортного возраста рожениц значимых корреляционных связей не зафиксировано.

Характеристика группы монохориальных близнецов в зависимости от типа осложнений внутриутробного периода представлена на рис. 3.

Проанализирована зависимость между количественным содержанием молекул TREC и KREC у монохориальных близнецов на 7-е сутки жизни и наличием специфических осложнений в антенатальном периоде (табл. 3).

При анализе уровней молекул TREC выявлено достоверное снижение в группе монохориальных близнецов, перенесших ФФТС, по сравнению с группой СЗРП (р=0,039) и монохориальными близнецами с неосложненным течением антенатального периода (р=0,032).

При изучении количества молекул KREC статистически значимое повышение уровня зафиксировано в группе монохориальных близнецов с признаками СЗРП по отношению к показателю группы монохориальных близнецов с неосложненным течением антенатального периода (р=0,021).

Разработанный метод определения количества молекул TREC и KREC широко используется для оценки состояния тимуса и костного мозга при различных физиологических и патологических состояниях. Количественные показатели молекул TREC и KREC в крови могут рассматриваться как критерии высокой диагностической значимости при различных иммунодефицитных состояниях [34-36]. У женщин в периоде беременности были диагностированы и проанализированы следующие инфекционно-воспалительные заболевания: острые респираторные инфекции (43 женщины, или 35,8%), хронические цервико-вагинальные инфекции (22 пациентки, или 18,3%), инфекции мочевых путей (14 беременных, или 11,7%). Статистически значимой связи наличия указанных заболеваний у беременных с монохориальным многоплодием и количеством молекул TREC и KREC у монохориальных близнецов на 7-е сутки жизни не обнаружено (р>0,05). Исключение выявлено для инфекции мочевых путей с бактериурией у беременных (код по МКБ‑10 О23): выявлена обратная корреляционная зависимость наличия данного заболевания содержания KREC у монохориальных близнецов (r= -0,267; p=0,003).

Мы провели поиск корреляционных зависимостей количества молекул TREC и KREC с инфекционно-воспалительными заболеваниями в раннем неонатальном периоде, а также показателями общего анализа крови на 7-е сутки жизни у монохориальных близнецов (табл. 4).

У детей, имеющих врожденную пневмонию, отмечается достоверное снижение TREC (750 [400; 1292] vs 1236 [795; 1766], p=0,007) и KREC (1446 [814; 2187] vs 1964 [1012; 3310], p=0,045) по сравнению с новорожденными без этого заболевания.

Выявлена отрицательная корреляционная связь между количеством молекул TREC и KREC на 7-е сутки жизни и наличием различных инфекционно-воспалительных заболеваний в раннем неонатальном периоде и содержанием сегментоядерных нейтрофилов (%, абс.), а также положительная корреляция между уровнями TREC и количеством лимфоцитов (%, абс.).

Инфекционно-воспалительные заболевания в возрасте 7 сут жизни были зарегистрированы у половины наблюдаемых монохориальных близнецов - 60 (50,0%). Наиболее часто инфекционные заболевания отмечены в группе ФФТС - у 18 (60,0%) из 30 детей, в группе СЗРП - у 20 (50,0%) из 40 пациентов, в контрольной группе - у 22 (44,0%) из 50 новорожденных; достоверных различий по указанному признаку не выявлено (p>0,05). Результаты исследований выявили возможную связь достоверно низких значений TREC и тенденцию к повышенной инфекционной заболеваемости в раннем неонатальном периоде у монохориальных близнецов, перенесших ФФТС.

Характеристика инфекционно-воспалительной патологии у недоношенных монохориальных близнецов представлена на рис. 4.

Врожденная пневмония была выявлена при объективном и рентгенологическом обследовании в течение 72 ч жизни у 30 (25,0%) монохориальных близнецов: у пациентов из группы ФФТС достоверно чаще, чем в группе СЗРП (χ²=0,022; p=0,021). Статистически значимых различий по частоте встречаемости других инфекционных болезней, специфичных для перинатального периода (код по МКБ‑10 Р39), не отмечено.

Ранний неонатальный сепсис был диагностирован у 6 (5,0%) новорожденных в возрасте первых 48-72 ч жизни. При обследовании в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных положительная гемокультура получена у 3 пациентов (во всех случаях грамположительная микрофлора): в 2 случаях - S. epidermidis и в 1 наблюдении - E. faecium. При сравнении микрофлоры, выделенной из цервикального канала у преждевременно родоразрешенных, и гемокультуры, обнаруженной у детей, рожденных данными женщинами, идентичных микроорганизмов не обнаружено (анализировали пары "мать-новорожденный"). Факт, что все новорожденные с ранним неонатальным сепсисом родились методом кесарева сечения, может отчасти объяснить полученный результат. Ранний неонатальный сепсис был диагностирован у 1 монохориального близнеца ГВ 35 нед с большей массой тела при рождении из контрольной группы, а также у обоих монохориальных близнецов в паре из контрольной группы, рожденных в ГВ 25 нед; у 3 монохориальных близнецов с СЗРП (гестационный возраст 29, 31 и 33 нед).

Характеристика результатов показателей общего анализа крови в возрасте 7 сут жизни у наблюдаемые монохориальных близнецов в зависимости от наличия инфекционно-воспалительных заболеваний в раннем неонатальном периоде представлена в табл. 5.

При изучении результатов показателей общего анализа крови в возрасте 7 сут жизни для наблюдаемых монохориальных близнецов, имеющих проявления инфекции в раннем неонатальном периоде, характерен более низкий ГВ (р<0,0001) по сравнению с группой монохориальных без указанных проявлений. Достоверные изменения выявлены по количеству лейкоцитов (р=0,037) и показателям лейкоцитарной формулы (моноцитов - р=0,039 и сегментоядерных нейтрофиллов - р=0,005), а также по количеству эритроцитов (р=0,013) и уровню гематокрита (р=0,05). При анализе других лабораторных проявлений системной воспалительной реакции в возрасте 7 сут жизни (нейтрофильный индекс, С-реактивный белок, прокальцитониновый тест, количество тромбоцитов) корреляционных связей с количеством TREC и KREC не выявлено. Это можно объяснить своевременной диагностикой инфекционного заболевания и назначением адекватной лекарственной терапии у наблюдаемых монохориальных близнецов.

Проведен анализ количества молекул KREC (рис. 5) и TREC (рис. 6) в зависимости от наличия инфекционно-воспалительных заболеваний в раннем неонатальном периоде у монохориальных близнецов, разделенных на группы с учетом специфических антенатальных осложнений.

Анализ количества молекул KREC (см. рис. 5) у монохориальных близнецов группы СЗРП без проявлений инфекции раннего неонатального периода показал достоверные различия по отношению к новорожденным контрольной группы (р=0,036); по отношению к группе ФФТС достоверные различия не определялись (р>0,05). В группах монохориальных близнецов с проявлениями инфекции в раннем неонатальном периоде достоверных различий не обнаружено (p>0,05).

Достоверных различий по количественным значениям молекул TREC (см. рис. 6) в анализируемых группах монохориальных близнецов с учетом наличия/отсутствия инфекционного заболевания в раннем неонатальном периоде не выявлено (p>0,05).

В группе монохориальных близнецов с признаками СЗРП на фоне течения инфекционно-воспалительного заболевания в раннем неонатальном периоде отмечена тенденция к повышению уровней TREC, что, возможно, свидетельствует о повышенной функциональной активности тимуса компенсаторного характера и требует дальнейшего изучения.

Мы изучили корреляционные связи между ГВ и показателями TREC и KREC по группам монохориальных близнецов с учетом наличия специфических осложнений антенатального периода (рис. 7). В группе с неосложненным течением антенатального периода (отсутствие ФФТС и СЗРП) корреляционных зависимостей молекул TREC и KREC с ГВ не выявлено: r=0,008; p=0,957 и r= -0,008, р=0,958 соответственно. В группах с осложненным течением внутриутробного периода получены статистически значимые положительные корреляционные связи между ГВ и уровнем TREC: в группе ФФТС r=0,535; р=0,03; в группе СЗРП r=0,471; р=0,002. Корреляционная зависимость между ГВ и количеством молекул KREC в группах ФФТС и СЗРП не отмечена (r=0,132; р=0,502 и r=0,004; р=0,979 соответственно).

Анализ количества молекул TREC (копий/10⁵ лейкоцитов) на 7-е сутки жизни в сухих образцах крови недоношенных монохориальных близнецов с учетом ГВ представлен в табл. 6.

В группе монохориальных близнецов, перенесших ФФТС, ГВ 32/0-33/6 нед выявлено статистически значимое повышение уровня молекул TREC по сравнению с ГВ <31,6 нед. В группе монохориальных близнецов с признаками СЗРП достоверно значимое повышение содержания молекул TREC отмечено в группах ГВ 32/0-33/6 по сравнению с ГВ 34/0-36/6 нед. При сравнительной характеристике между группами монохориальных близнецов, перенесших ФФТС и СЗРП, статистически значимые различия отмечены при ГВ 28/0-31/6 нед.

Проведенный статистический анализ уровней TREС в зависимости от ГВ в образцах сухой крови недоношенных монохориальных близнецов со специфическими осложнениями внутриутробного периода позволили нам объединить промежутки ГВ с учетом полученных статистически значимых различий (рис. 8): между I и II периодом ГВ (р=0,001); между II и III периодом ГВ (р=0,017).

Периоды ГВ с учетом статистически значимых различий:

· I период ГВ - группа ФФТС ГВ 25/0-31/6 нед;

· II период ГВ - группа СЗРП ГВ 28/0-31/6 нед + группа ФФТС+СЗРП ГВ 32/0-33/6 нед;

· III период ГВ - группа ФФТС+СЗРП ГВ 34/0-36/6 нед.

Снижение Т-клеточного иммунитета по показателям ДНК TREС при осложненном течении внутриутробного периода у монохориальных близнецов наблюдалось в ГВ 25/0-31/6 нед.

Обсуждение

Частота осложненного течения как антенатального, так и раннего неонатального периода у недоношенных новорожденных выше, чем у доношенных, что связано с морфофункциональной незрелостью органов и систем организма, в том числе с иммунными нарушениями. Прогностическое значение иммунных нарушений, выявленных методом количественной оценки содержания TREC/KREC, для прогноза инфекционных осложнений в группе недоношенных имеет большое значение. К настоящему времени проведено множество исследований уровней TREC/KREC в различных возрастных группах на фоне ПИД, которые представляют собой гетерогенную группу врожденных дефектов иммунной системы [29, 37]. Также концентрации TREC и KREC могут быть использованы для контроля иммунной системы при различных заболеваниях, которые могут повлиять на процесс лимфопоэза и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов. В литературе уже появляются публикации об актуальности изучения количественных показателей TREC и KREC у пациентов с сепсисом, ВИЧ, туберкулезом, онкологическими и гематологическими заболеваниями [30, 31, 38]. Эксцизионные рекомбинантные кольца Т-клеточного рецептора (T-cell Receptor Excision Circle, TREC) и В-клеточного рецептора (Kappa-deleting Recombination Excision Circle, KREC) представляют собой кольцевые фрагменты ДНК, образующиеся при перестройке гена TCR в тимоцитах и гена BCR в В-клетках из костного мозга. В результате концентрация молекул TREC отражает содержание именно наивных Т-клеток, а уровень молекул KREC - наивных В-клеток и, по мнению исследователей, они являются суррогатными маркерами функционального состояния тимуса и костного мозга соответственно [39-41]. Для практического использования результатов содержания маркеров наивных Т- и В-клеток важно иметь представление о факторах риска снижения содержания молекул TREC и KREC группе монохориальных близнецов.

Согласно результатам группы исследователей [32], статистически значимых отличий между степенью доношенности и содержанием TREC не выявлено, определялась только тенденция к повышению содержания молекул TREC по мере увеличения ГВ. В указанном исследовании не учитывался фактор хориальности. По нашим данным, у недоношенных новорожденных гестационного возраста 25/0-31/6 нед выявлены достоверно низкие уровни TREC, что свидетельствует об угнетении Т-клеточного иммунитета (р<0,0001). При разделении новорожденных на группы с учетом хориальности у дихориальных недоношенных близнецов наблюдалось статистически значимое повышение количества KREC, что характерно для активации В-клеточного иммунитета (p<0,05).

Одной из задач нашей работы являлось определение содержания молекул TREC и KREC в крови монохориальных близнецов ГВ 25/0-36/6 нед, перенесших специфические осложнения антенатального периода (ФФТС и СЗРП). При монохориальной беременности возможно развитие указанных специфических осложнений, обусловленных наличием сосудистых анастомозов и межплодовой трансфузии крови (ФФТС), а также неравномерным распределением плаценты между близнецами и формированием СЗРП [42, 43], и, как следствие, высокий риск неонатальных осложнений у монохориальных близнецов и негативных отдаленных последствий в виде развития различных заболеваний. Изучению патофизиологии созревания и функционирования различных органов и систем у монохориальных близнецов уделяется большое внимание, при этом публикаций, посвященных прицельному исследованию значений молекул TREC и KREC, мы не нашли.

Мы проанализировали зависимость между количественным содержанием молекул TREC и KREC и следующими показателями антенатального и раннего неонатального периода: ФФТС и СЗРП, ГВ, хориальностью, наличием инфекционно-воспалительных заболеваний у беременных и их новорожденных, показателями общего анализа крови и другими маркерами инфекционно-воспалительных заболеваний на 7-е сутки жизни. По нашим данным, рост и дифференцировка тимогенных тканей у монохориальных близнецов с осложненным течением внутри­утробного периода происходит в соответствии с гестационными периодами и имеет более постепенный и пролонгированный характер, что косвенно подтверждается увеличением количества маркеров Т-клеток в динамике ГВ.

Определены корреляционные связи между количественной оценкой TREC/KREC у монохориальных близнецов и показателями общего анализа крови, а также инфекционными заболеваниями в раннем неонатальном периоде. При осложненном течении монохориального многоплодия диагностированы особенности иммунитета. При анализе уровней молекул TREC выявлено достоверное снижение в группе монохориальных близнецов, перенесших ФФТС, по сравнению с группой СЗРП (р=0,039) и монохориальными близнецами с неосложненным течением антенатального периода (р=0,032), что позволяет предположить у новорожденных монохориальных близнецов, перенесших трансфузионный синдром, снижение функциональной активности тимуса. При изучении количества молекул KREC статистически значимое повышение уровня зафиксировано в группе монохориальных с признаками СЗРП по отношению к монохориальных близнецам с неосложненным антенатальным периодом (р=0,021), что, возможно, свидетельствует о более активной дифференцировке В-клеток в костном мозге.

Выявленные значимые отрицательные корреляционные зависимости между содержанием TREC/KREC у монохориальных близнецов и заболеванием их матерей в периоде беременности инфекцией мочевых путей с бактериурией и инфекционно-воспалительными заболеваниями в раннем неонатальном периоде, вероятно, свидетельствуют о снижении активности дифференцировки В-клеток в костном мозге и снижении темпов созревания Т-клеток в тимусе. При этом для монохориальных близнецов, имеющих проявления инфекции в раннем неонатальном периоде, характерен более низкий ГВ (р<0,0001) по сравнению с группой монохориальных близнецов без указанных проявлений.

Проанализирована и выявлена положительная корреляционная зависимость между количественным содержанием маркеров наивных Т-клеток (TREC) и ГВ новорожденных с осложненным течением антенатального периода: в группе ФФТС - r=0,535; p=0,03 и группе СЗРП - r=0,471; p=0,002.

Проведенный статистический анализ уровней TREC позволил нам выделить у монохориальных близнецов с осложненным течением внутриутробного периода определенные периоды ГВ, связанные с ростом и дифференцировкой тимогенных тканей, что, возможно, свидетельствует о более пролонгированном процессе по сравнению с монохориальными близнецами при неосложненном антенатальном периоде. Наши данные совпадают с результатами других исследователей [44, 45] и подтверждают высокую эффективность гуморальных параметров иммунитета у монохориальных близнецов независимо от особенностей внутриутробного развития: отсутствие зависимости между количественным содержанием маркеров В-клеток и ГВ. Выявленные количественные изменения ДНК TREC и KREC подтверждают биологическую уникальность монохориальных беременностей и побуждают к дальнейшим исследованиям с целью изучения закономерностей и механизмов, влияющих на развитие иммунной системы у недоношенных монохориальных близнецов.

Результаты нашего исследования показывают зависимость уровней TREC и KREC у недоношенных новорожденных от ГВ, хориальности, специфических осложнений антенатального периода, наличия инфекционно-воспалительных заболеваний в раннем неонатальном периоде. Дальнейшее изучение содержания ДНК TREC и KREC позволит оптимизировать постнатальное ведение недоношенных новорожденных с целью профилактики инфекционных осложнений.

Ограничения исследования: результаты настоящего исследования были получены на небольших выборках пациентов монохориальных двоен ГВ 25/0-27/6 нед, на фоне отсутствия пациентов с СЗРП ГВ 25/0-27/6 нед. Для дальнейшей работы необходимо проведение исследования с большим объемом выборки.

Заключение

Уровень TREC у монохориальных близнецов зависит от ГВ и наличия специфических осложнений антенатального периода (ФФТС и СЗРП), что необходимо учитывать при интерпретации результатов расширенного неонатального скрининга.

Литература

1. Prefumo F., Fichera A., Pagani G., Marella D., Valcamonico A., Frusca T. The natural history of monoamniotic twin pregnancies: a case series and systematic review of the literature // Prenatal Diagn. 2015. Vol. 35, N 3. P. 274-280.

2. Цибизова В.И., Говоров И.Е., Аверкин И.И., Хамани Н.М., Блинов Д.В. Оценка медицинских технологий в акушерстве: преимущества индивидуального консервативного ведения монохориальной беременности, осложненной синдромом обратной артериальной перфузии, перед хирургическим вмешательством // ФАРМАКОЭКОНОМИКА. Современная фармакоэкономика и фармакоэпидемиология. 2020. Т. 13, № 1. С. 36-42. DOI: https://doi.org/10.17749/2070-4909.2020.13.1.36-42

3. Batsry L., Matatyahu N., Avnet H., Weisz B., Lipitz S., Mazaki-Tovi S. et al. Perinatal outcome of monochorionic diamniotic twin pregnancy complicated by selective intrauterine growth restriction according to umbilical artery Doppler flow pattern: single-center study using strict fetal surveillance protocol // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2021. Vol. 57, N 5. P. 748-755.

4. Клинические рекомендации "Многоплодная беременность". Москва, 2021. 86 с.

5. Костюков К.В., Ионов О.В., Шакая М.Н. Оценка перинатальных исходов при дискордантном весе новорожденных из двойни // Акушерство и гинекология. 2020. № 5. С. 78-84.

6. Павличенко М.В., Косовцова Н.В., Башмакова Н.В., Маркова Т.В. Перинатальные исходы при различных методах внутриутробной хирургической коррекции синдрома фето-фетальной трансфузии при беременности монохориальной диамниотической двойней // Российский вестник акушера-гинеколога. 2017. № 17. С. 33-38.

7. Nikkels P.G.J., Hack K.E.A., van Gemert M.J.C. Pathology of twin placentas with special attention to monochorionic twin placentas // J. Clin. Pathol. 2008. Vol. 61. P. 1247-1253.

8. Delabaereab A., Boucheta P., Sendya F., Petillona F., Gallotac D. Management of monoamniotic twin pregnancies: where, when, how? // J. Gynecol. Obstet. Hum. Reprod. 2022. Vol. 51, N 1. Р. 138-145.

9. Micheletti T., Eixarch E., Bennasar M., Martinez J.M., Gratacos E. Complications of monochorionic diamniotic twins: stepwise approach for early identification, differential diagnosis, and clinical management // Maternal Fetal Med. 2021. Vol. 3, N 1. Р. 42-52.

10. Sperling L., Kiil C., Larsen L.U., Qvist I., Schwartz M., Jörgensen C. et al. Naturally conceived twins with monochorionic placentation have the highest risk of fetal loss // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2006. Vol. 28, N 5. Р. 644-652.

11. Couck I., Lewi L. The placenta in twin-to-twin transfusion syndrome and twin anemia polycythemia sequence // Twin Res. Hum. Genet. 2016. Vol. 19, N 3. Р. 184-190.

12. Brock C., Bergh E., Lai D., Johnson A., Ruano R., Blackwell S. et al. Prediction of fetal complications in monochorionic-diamniotic twins using sonographic characteristics // Am.J. Obstet. Gynecol. 2022. Vol. 226, N 1. Р. 632-635.

13. Batsry L., Matatyahu N., Avnet H., Weisz B., Lipitz S., Mazaki-Tovi S. et al. Perinatal outcome of monochorionic diamniotic twin pregnancy complicated by selective intrauterine growth restriction according to umbilical artery Doppler flow pattern: single-center study using strict fetal surveillance protocol // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2021. Vol. 57, N 5. Р. 748-755.

14. Meyts I., Bosch B., Bolze A. et al. Exome and genome sequencing for inborn errors of immunity // J. Allergy Clin. Immunol. 2016. Vol. 138, N 4. P. 957-969.

15. Murgano D., Khalil A., Prefumo F., Mieghem T.V., Rizzo G., Heyborne K.D. et al. Outcome of twin-to-twin transfusion syndrome in monochorionic monoamniotic twin pregnancy: systematic review and meta-analysis // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2020. Vol. 55, N 3. Р. 310-317.

16. Demela P., Pirastu N., Soskic B. Cross-disorder genetic analysis of immune diseases reveals distinct gene associations that converge on common pathways // Nat. Commun. 2023. Vol. 14, N 1. P. 2743.

17. Козлов В.А., Тихонова Е.П., Савченко А.А., Кудрявцев И.В., Андронова Н.В., Анисимова Е.Н. и др. Клиническая иммунология. Практическое пособие для инфекционистов. Красноярск : Поликор, 2021. 563 c.

18. Olbrich P., de Felipe B., Delgado-Pecellin C., Rodero R., Rojas P., Aguayo J. et al. [A first pilot study on the neonatal screening of primary immunodeficiencies in Spain: TRECS and KRECS identify severe T- and B-cell lymphopaenia] // An. Pediatr. (Barc.). 2014. Vol. 81, N 5. P. 310-317.

19. Ипполитова Л.И., Иванцова Е.Н., Кудлай Д.А., Паничев К.В., Кокорева С.П. TREC и KREC у новорожденных разного гестационного возраста // Молекулярная медицина. 2023. Т. 21, № 3. C. 65-72.

20. de Felipe B., Olbrich P., Lucenas J.M., Delgado-Pecellin C., Pavon-Delgado A., Marquez J. et al. Prospective neonatal screening for severe T- and B- lymphocyte deficiencies in Seville // Pediatr. Allergy Immunol. 2016. Vol. 27, N 1. P. 70-77.

21. Сайтгалина М.А., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Семенов А.В., Кузнецова Р.Н., Тотолян А.А. Модифицированный метод количественного определения уровней TREC и KREC в периферической крови у больных с иммунодефицитными состояниями // Инфекция и иммунитет. 2022. Т. 12, № 5. C. 981-996.

22. Давыдова Н.В., Продеус А.П., Образцов И.В. и др. Референсные значения концентрации TREC и KREC у взрослых // Врач. 2021. Т. 32, № 6 С. 21-28.

23. Тузанкина И.А., Дерябина С.С., Болков М.А. и др. Первичные иммунодефициты (врожденные ошибки иммунитета) в раннем возрасте. Ташкент: Adast-poligraf, 2022. 232 c.

24. Об утверждении порядка оказания медицинской помощи пациентам с врожденными и (или) наследственными заболеваниями: приказ Министерства здравоохранения РФ от 21 апреля 2022 г. № 274н (вступил в силу 1 января 2023 г.). Москва, 2023.

25. Аналитический вестник № 14 (757). О деятельности медико-генетических консультаций и центров в субъектах Российской Федерации. Материалы заседания Совета по региональному здравоохранению при Совете Федерации Федерального Собрания Российской Федерации (Совет Федерации, 25 сентября 2020 года). Москва, 2020. 64 с.

26. Корсунский И.А., Кудлай Д.А., Продеус А.П. и др. Неонатальный скрининг на первичные иммунодефицитные состояния и Т-/В -клеточные лимфопении как основа формирования групп риска детей с врожденными патологиями // Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2020. Т. 99, № 2. С. 8-15.

27. Гордукова М.А., Корсунский И.А., Чурсинова Ю.В., Бяхова М.М., Оскорбин И.П., Продеус А.П. и др. Определение референсных интервалов TREC и KREC для скрининга новорожденных с иммунодефицитными состояниями в РФ // Медицинская иммунология, 2019. Т. 21, № 3. С. 527-538.

28. Болков М.А., Тузанкина И.А, Шинвари Х., Черемохин Д.А. Классификация врожденных ошибок иммунитета человека, обновленная экспертами комитета Международного союза иммунологических обществ в 2019 году // Российский иммунологический журнал. 2021. Т. 24, № 1. С. 7-68.

29. Wakamatsu M., Kojima D., Muramatsu H., Okuno Y., Kataoka S., Nakamura F. et al. TREC/KREC newborn screening followed by next-generation sequencing for severe combined immunodeficiency in Japan // J. Clin. Immunol. 2022. Vol. 42, N 8. Р. 1696-1707.

30. Medova V., Hulinkova I., Laiferova N., Urdova V., Ciznar P., Dolnikova D. et al. The importance of defining the age-specific TREC/KREC levels for detection of various inborn errors of immunity in pediatric and adult patients // Clin. Immunol. 2022. Vol. 245. Article ID 109155.

31. Stinson L.F., Boyce M.C., Payne M.S., Keelan J.A. The not-so-sterile womb: evidence that the human fetus is exposed to bacteria prior to birth // Front. Microbiol. 2019. Vol. 10. Article ID 1124.

32. Черемохин Д.А., Шинвари Х., Дерябина С.С., Болков М.А., Тузанкина И.А., Кудлай Д.А. Анализ уровней TREС и KREC в образцах сухой крови новорожденных разного гестационного возраста и веса // Acta Naturae. 2022. Т. 14, № 1. С. 101-108.

33. Дерябина С.С., Тузанкина И.А., Шершнев В.Н. Определение нормативных значений TREC и KREC в сухих пятнах крови новорожденных разного срока гестации в Свердловской области // Медицинская иммунология. 2018. № 20. С. 85-98.

34. Chan S.B., Zhong Y., Lim S.C.J., Poh S., Teh K.L., Soh J.Y. et al. Implementation of universal newborn screening for severe combined immunodeficiency in Singapore while continuing routine Bacille-Calmette-Guerin vaccination given at birth // Front. Immunol. 2022. Vol. 3, N 12. Article ID 794221.

35. Devonshire A.L., Makhija M. Approach to primary immunodeficiency // Allergy Asthma Proc. 2019. Vol. 40, N 6. Р. 465-469.

36. Tavako M., Jamee M., Azizi G. et al. Diagnostic approach to the patients with suspected primary immunodeficiency // Endocr. Metab. Immune Disord. Drug Targets. 2020. Vol. 20, N 2. Р. 157-171.

37. Shinwari K., Bolkov M., Tuzankina I.A., Chereshnev V.A. Newborn screening through TREC, TREC/KREC system for primary immunodeficiency with limitation of TREC/KREC. Comprehensive review // Antiinflamm. Antiallergy Agents Med. Chem. 2021. Vol. 20, N 2. Р. 132-149.

38. Pogorelyy M.V., Elhanati Y., Marcou Q., Sycheva A.L., Komech E.A., Nazarov V.I. et al. Persisting fetal clonotypes influence the structure and overlap of adult human T cell receptor repertoires // PLoS Comput. Biol. 2017. Vol. 13, N 7. Article ID e1005572.

39. Козлов В.А., Савченко А.А., Кудрявцев И.В. и др. Клиническая иммунология. Красноярск: Поликор, 2020. 386 с.

40. Дерябина С.С. Неонатальный скрининг: этические вопросы расширения спектра скринируемых заболеваний // Вопросы современной педиатрии. 2015. Т. 14, № 6. С. 714-723.

41. Витковская И.П., Печатникова Н.Л., Петряйкина Е.Е., Колтунов И.Е. Раннее выявление врожденных и наследственных заболеваний (неонатальный скрининг, селективный скрининг). Опыт региона и перспективы развития // РМЖ. Медицинское обозрение. 2018. Т. 2, № 1. С. 62-66.

42. Fisk N.M., Duncombe G.J., Sullivan M.H. The basic and clinical science of twin-twin transfusion syndrome // Placenta. 2009. Vol. 30. P. 379-390.

43. Lewi L., Deprest J., Hecher K. The vascular anastomoses in monochorionic twin pregnancies and their clinical consequences // Am.J. Obstet. Gynecol. 2013. Vol. 208. P. 19-30.

44. Yi J.S., Rosa-Bray M., Staats J., Zakroysky P., Chan C., Russo M.A. et al. Establishment of normative ranges of the healthy human immune system with comprehensive polychromatic flow cytometry profiling // PLoS One. 2019. Vol. 14, N 12. Article ID e0225512.

45. Carlson L.M., Vora N.L. Prenatal diagnosis: screening and diagnostic tools // Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 2017. Vol. 44, N 2. P. 245-256.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)