Циркулирующие мкРНК как ранний индикатор инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных

• Тимофеева Анжелика Владимировна
• Никитина Ирина Владимировна
• Гусар Владислава Анатольевна
• Чаговец Виталий Викторович
• Киртбая Анна Ревазиевна
• Ионов Олег Вадимович
• Дегтярев Дмитрий Николаевич
• Кан Наталья Енкыновна
• Франкевич Владимир Евгеньевич

Резюме

Инфекционно-воспалительные заболевания у новорожденных, возникающие на фоне морфофункциональной незрелости иммунной системы, зачастую имеют стертую клиническую картину и остаются главной причиной смертельных исходов, в особенности глубоконедоношенных детей. Актуальным является поиск специфичных биомаркеров для своевременной неинвазивной диагностики и лечения данных заболеваний. Одними из ключевых регуляторов работы всех систем организма являются малые некодирующие РНК, в частности мкРНК, используемые для неинвазивной диагностики широкого спектра заболеваний, в том числе неонатального периода.

Цель - анализ уровня экспрессии мкРНК, потенциально регулирующих трансляцию IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, IFNγ, CCL2, GM-CSF, в плазме периферической крови у детей различного гестационного возраста с дыхательными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза в первые сутки жизни.

Материал и методы. Методом ОТ-ПЦР в реальном времени проведена количественная оценка hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в 81 образце плазмы крови 3 групп новорожденных различного гестационного возраста: 25-28, 29-31 и 32-40 нед, с применением коммерческих наборов Serum Plasma kit, miScript® II RT Kit, SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Германия).

Результаты. В плазме периферической крови новорожденных, родившихся на 32-40-й неделе гестации (н.г.), методом ОТ-ПЦР выявлено достоверное повышение уровня экспрессии hsa-miR-92a-3p и hsa-miR-130a-3p в случае диагностированной врожденной пневмонии (ВП), раннего неонатального сепсиса (РНС) и hsa-miR-16-5p в случае РНС относительно новорожденных с транзиторным тахипноэ (ТТН) и респираторным дистресс-синдромом (РДС). Непараметрическим методом ранговой корреляции по Спирмену обнаружена достоверная корреляция между уровнем экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p и ВП; hsa-miR-16-5p, -92a-3p и РНС; hsa-miR-92a-3p и балльной оценкой по шкале NEOMOD, характеризующей степень выраженности полиорганной недостаточности. В группе новорожденных в возрасте 25-31 н.г. продемонстрирована возможность дифференциальной диагностики ВП и РНС по уровню экспрессии hsa-miR-16-5p и hsa-miR-130a-3p в плазме крови. Найдена достоверная корреляция по Спирмену между уровнем экспрессии hsa-miR-16-5p и наличием внутрижелудочкового кровоизлияния (ВЖК) у детей с ВП или РНС, а также с балльной оценкой по шкале Сильвермана, характеризующей степень выраженности дыхательных расстройств у новорожденных.

Заключение. Впервые продемонстрирована значимость изменения уровня экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в плазме крови новорожденных различного гестационного возраста в диагностике ВП, РНС и ВЖК. Использование в клинической практике оценки уровня экспрессии мкРНК в плазме периферической крови новорожденных в сочетании с традиционным клинико-лабораторным обследованием позволит обеспечить более точную и раннюю диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний, таких как ВП и РНС, в особенности у глубоконедоношенных детей.

Ключевые слова:мкРНК, плазма периферической крови, ОТ-ПЦР в реальном времени, врожденная пневмония, ранний неонатальный сепсис, внутрижелудочковое кровоизлияние, новорожденный

Список сокращений

Количественная ПЦР в реальном времени

Синтезированную кДНК (2 мкл) использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени c применением смысловых праймеров, специфичных для hsa-miR-16-5p (5’-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG, Tm = 62 °C), hsa-miR-92a-3p (5’-TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT, Tm = 60 °C), hsa-miR-130a-3p (5’-CAGTGCAATGTTAAAAGGGCAT, Tm = 49 °C), hsa-miR-223-3p (5’-TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA, Tm = 56 °C), cel-miR-39 (miScript Primer Assay, Ce_miR-39_1, Qiagen, Германия, Tm = 55 °C) и однократной реакционной смеси (SYBR PCR Master Mix) с добавленным однократным универсальным антисмысловым праймером (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Германия). Протокол амплификации: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95 °C, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНК при 94 °C в течение 15 с, отжиг смыслового и антисмыслового праймеров при оптимизированной температуре (49-62 °C) в течение 30 с, удлинение праймеров при 70 °C в течение 30 с с детекцией флюоресцентного сигнала после каждого цикла реакции, (3) построение кривых плавления продукта ПЦР (нагревание реакционной смеси с 65 до 95 °С с шагом 0,1 °С, сопровождающееся детекцией флюоресцентного сигнала на каждом шаге) в амплификаторе StepOne-Plus^TM thermocycler (Applied Biosystems, USA). Специфичность амплификации оценивали по кривым плавления продукта ПЦР. Относительный уровень экспрессии кДНК вычисляли по разнице пороговых циклов амплификации кДНК анализируемой мкРНК (hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p) и нормировочной экзогенной мкРНК (cel-miR-39) в одном и том же образце. Анализ значимости различий медианы ACt мкРНК в сравниваемых группах новорожденных выполняли с использованием двустороннего теста Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты

Биоинформатический поиск мкРНК-потенциальных регуляторов иммунного ответа

С помощью базы данных miRWalk, miRanda, RNA22 и Targetscan были выбраны четыре мкРНК - hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p, потенциально регулирующие основные звенья иммунного ответа (табл. 2), а именно: пополнение пула гранулоцитарно-макрофагальной популяции клеток (GM-CSF), активация которых при контакте с патогеном ведет к выбросу провоспалительных цитокинов (в том числе IL-1β, IL-6, TNF-α, IFNγ), противовоспалительных цитокинов (например, IL-10, IL-13) и хемокинов (среди прочих IL-8, CCL2). От соотношения медиаторов воспалительной реакции зависит ее исход - разрешение или усугубление с развитием осложнений, в том числе септических. Известно, что иммунный ответ неонатального периода сдвинут в сторону регуляторного Th2-типа относительно провоспалительного Th1-типа, обеспечивая тем самым пролонгирование и физиологическое течение беременности, но обусловливая высокую уязвимость к патогенным микроорганизмам [17, 18]. Представлялось интересным проанализировать возможность дифференцировать респираторные нарушения инфекционного и неинфекционного генеза по уровню экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -2233p в плазме периферической крови новорожденных разного гестационного возраста.

Анализ экспрессии мкРНК в плазме периферической крови новорожденных, родившихся на сроке беременности более 32 нед гестации

В группе детей, рожденных после 32-й недели гестации (3-я группа, см. табл. 1), проведен сравнительный анализ уровня экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в подгруппах 2, 3 и 4 относительно контрольной подгруппы 1 (см. табл. 1, рис. 1). Не выявлено статистически значимых различий в уровне экспрессии перечисленных мкРНК между подгруппами с респираторными нарушениями неинфекционного генеза (РДС и ТТН), т.е. между 2-й и 1-й подгруппой соответственно. Содержание hsa-miR-16-5p в плазме крови новорожденных с РНС (4-я подгруппа) было значимо выше такового у детей с ТТН (1-я подгруппа, p=0,019) и детей с РДС (2-я подгруппа, p=0,05). Уровень экспрессии hsa-miR-92a-3p был повышен у новорожденных с ВП (p=0,002) и РНС (p=0,004) по сравнению c показателями детей с ТТН. У детей с ВП и РНС было достоверно повышено содержание hsa-miR-130a-3p как при сравнении с детьми с ТТН (p=0,002 и p=0,019 соответственно), так и с детьми с РДС (p=0,001 и p=0,025 соответственно).

C целью статистического анализа взаимосвязи уровня экспрессии мкРНК (значения ACt) в плазме периферической крови новорожденных с клинико-анамнестическими параметрами был применен непараметрический метод ранговой корреляции по Спирмену (табл. 3). Была выявлена отрицательная достоверная корреляция между уровнем экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p и наличием у новорожденного ВП. Важно отметить, что чем больше значение ACt, тем ниже уровень экспрессии, т.е. отрицательная корреляция между ACt и клиниколабораторным параметром свидетельствует о наличии корреляции между повышением уровня экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p и диагностированной ВП. Повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p и hsa-miR-92a-3p достоверно коррелировало с наличием как РНС, так и лейкоцитоза у новорожденных, а hsa-miR-92a-3p - с повышением балльной оценки по шкале NEOMOD, характеризующей степень выраженности полиорганной недостаточности.

Анализ уровня экспрессии мкРНК в плазме периферической крови у новорожденных, родившихся на сроке беременности менее 32 нед гестации

При анализе уровня экспрессии мкРНК в плазме периферической крови новорожденных 1-й и 2-й групп (см. табл. 1) обращало на себя внимание наличие ВЖК II и III степени у всех детей с диагнозом ВП, у 4 из 7 детей с диагнозом РНС 1-й группы, у 4 из 9 детей с диагнозом РНС 2-й группы, в отличие от детей с диагнозом РДС 2-й группы, у которых ВЖК не было. В связи с тем что ВЖК имеет многофакторный генез и основными факторами возникновения являются внутриутробная гипоксия, недоношенность и внутриутробная инфекция [19], важно было учитывать наличие данного патологического состояния при сравнении подгрупп внутри 1-й и 2-й групп детей. Кроме того, при использовании непараметрического метода ранговой корреляции по Спирмену была выявлена отрицательная корреляция между значением ACt hsa-miR-16-5p и наличием ВЖК у новорожденных (r=-0,4717, р=0,0037).

В 1-й группе выявлено достоверное повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p у детей с РНС, имеющих ВЖК, по сравнению с детьми с РНС без ВЖК (р=0,00761, рис. 2). Однако зависимости уровня экспрессии hsa-miR-16-5p от наличия ВЖК у детей II группы с РНС не обнаружено. При отсутствии ВЖК у детей с РНС наблюдали зависимость уровня экспрессии hsa-miR-16-5p от гестационного возраста (2-я подгруппа 1-й группы в сравнении с 3-й подгруппой 2-й группы, р=0,03475) в виде повышения содержания hsa-miR-16-5p в плазме периферической крови с увеличением срока беременности. Напротив, при сопоставлении 2-й подгруппы 1-й группы и 3-й подгруппы 2-й группы детей с РНС и ВЖК наблюдали достоверное снижение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p с увеличением гестационного возраста (р=0,03812).

При сопоставлении 1-й и 2-й подгрупп внутри I группы обнаружено повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-223-3p у детей с РНС и ВЖК в сравнении с детьми с ВП и ВЖК (рис. 3), при этом достоверные изменения были выявлены лишь для hsa-miR-16-5p (p=0,032). Напротив, во 2-й группе при сопоставлении 2-й и 3-й подгрупп обнаружено достоверное снижение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p (p=0,050) у детей с РНС и ВЖК в сравнении с детьми с ВП и ВЖК (рис. 4). Важно отметить, что в настоящей работе в 1-й и 2-й группах обнаружена отрицательная корреляция между значением ACt hsa-miR-16-5p и балльной оценкой по шкале Сильвермана (r=-0,4548, p=0,0053), характеризующей степень выраженности дыхательных расстройств у новорожденного, и использованием в связи с дыхательной недостаточностью ИВЛ (r=-0,4312, p=0,0087) или ВЧОВЛ (r=-0,4267, p=0,0095) (см. табл. 3).

Сопоставление 1-й и 3-й подгрупп внутри 2-й группы не выявило никаких достоверных отличий в уровне экспрессии четырех анализируемых мкРНК у новорожденных с РНС без ВЖК относительно детей с РДС без ВЖК.

Необходимо отметить, что у всех детей с ВП из 1-й подгруппы 1-й группы и 2-й подгруппы 2-й группы было ВЖК II-III степени, и данные подгруппы достоверно отличались по уровню экспрессии hsa-miR-16-5p (p=0,048), hsa-miR-92a-3p (p=0,030), hsa-miR-130a-3p (p=0,003), hsa-miR-223-3p (p=0,048) с более высоким уровнем экспрессии в 2-й подгруппы 2-й группы (рис. 5). Эти данные демонстрируют зависимость уровня экспрессии перечисленных выше мкРНК от срока гестации, что может и обусловливать различия в иммунных реакциях при возникновении внутриутробной инфекции и, соответственно, различия в клинической картине ВП (см. табл. 1).

Найдены достоверные различия между РНС и ВП на разных сроках гестации по уровню экспрессии мкРНК в плазме периферической крови детей первых суток жизни: повышенная экспрессия hsa-miR-130a-3p у детей с РНС относительно детей с ВП, рожденных на сроке беременности 25-28 нед (p=0,003, рис. 6); сниженная экспрессия hsa-miR-16-5p у детей с РНС относительно детей с ВП, рожденных на сроке беременности 29-31 нед (p=0,023, рис. 7).

Гены-мишени дифференциально экспрессированных мкРНК

В рамках базы данных miRPathDB v1.1 (https://mpd.bioinf.uni-sb.de) с использованием внешней базы данных MiRTargetLink Human были найдены гены-мишени hsa-miR-16-5p (132 гена), -92a-3p (30 генов), -130a-3p (13 генов), -223-3p (40 генов). При этом регуляторная взаимосвязь пары "мкРНК/ген-мишень" была доказана экспериментально как минимум двумя независимыми исследованиями и расценивалась как strong (сильная). Система классификации генов KEGG (https://www.kegg.jp) позволила проанализировать функцию выявленных генов-мишеней, и информация об их участии в сигнальных путях, задействованных в иммунном ответе, оформлена в виде табл. 4.

Обсуждение

В настоящем исследовании в плазме периферической крови новорожденных первых суток жизни проанализирован уровень экспрессии четырех мкРНК - hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p, потенциально регулирующих пополнение пула гранулоцитарно-макрофагальной популяции клеток, синтез про- и противовоспалительных цитокинов и хемотаксис лейкоцитов, согласно базам данных miR-Walk, miRanda, RNA22 и Targetscan, в группах детей в возрасте 25-28, 29-31 и 32-40 н.г. с респираторными нарушениями неинфекционного и инфекционного генеза, осложненными ВЖК и без ВЖК. Выявлена зависимость уровня экспрессии данных мкРНК от гестационного возраста новорожденных, в связи с чем проанализирована связь респираторных нарушений с уровнем экспрессии мкРНК в каждой из трех анализируемых групп детей различного гестационного возраста в первые сутки жизни, а именно: повышенная экспрессия hsa-miR-130a-3p характерна для детей с РНС, рожденных на 25-28-й н.г.; сниженная экспрессия hsa-miR-16-5p является маркером РНС у детей в возрасте 29-31 н.г.; повышенная экспрессия hsa-miR-16-5p является признаком наличия ВЖК II-III степени в группе детей с РНС в возрасте 25-28 н.г.; повышенная экспрессия hsa-miR-92a-3p и hsa-miR-130a-3p ассоциирована с наличием ВП в группе детей возрастом 32-40 н.г.; в случае развития РНС повышена экспрессия hsa-miR-16-5p, hsa-miR-92a-3p и hsa-miR-130a-3p в группе детей в возрасте 32-40 н.г.

Обращает на себя внимание участие анализируемых мкРНК в регуляции дифференцировки Th1- и Th2-лимфоцитов, воздействуя на гены-мишени CHUK, IFNG, NOTCH2, RUNX3, STAT5A (PATH:ko04658, см. табл. 4). Согласно базе данных KEGG, пул Тh1-клеток образуется под действием провоспалительных цитокинов, характеризуется синтезом транскрипционного фактора T-bet, STAT4 и формирует клеточный иммунитет; напротив, противовоспалительные цитокины, уровень которых регулируется NOTCH1/2 и транскрипционными факторами GATA3, STAT5, STAT6 и др., направляют дифференцировку Т-клеток по Тh2-пути, участвующему в гуморальном иммунном ответе. Сбалансированность формирования Th1- и Тh2-подтипов Т-хелперов, в которой ключевую роль играют ингибитор альфа-субъединицы киназы ядерного фактора каппа-В (CHUK) и транскрипционный фактор RUNX3 [20], определяет подверженность организма к действию инфекционного агента и способность ему противостоять. В свою очередь, цитокины IL-4, IL-27 Th2-клеток и цитокин IFNG Th1-клеток путем активации STAT5, STAT6 и STAT1 соответственно ингибируют дифференцировку CD4+ Т-клеток в клетки Th17 (PATH:ko04659), продуцирующих IL-17, IL-21 и IL-22 под действием транскрипционных факторов STAT3, ROR(gamma)t, SMAD, mTOR в ответ на активацию антигенпрезентирующих клеток и синтеза ими TGFB, IL-6, IL-1, IL-23 и IL-21. Ингибирование дифференцировки Т-хелперов в Th17-клетки необходимо для предупреждения чрезмерной воспалительной реакции и защиты тканей от повреждения. При этом индукция синтеза цитокинов воспаления и хемокинов в дендритных клетках, макрофагах и нейтрофилах происходит через рецепторы лектина C-типа (CLRs), которые узнают бактериальные, дрожжевые и грибковые паттерны (в частности, бета-глюканы и углеводы маннозного типа), уровень синтеза которых и определяет дифференцировку CD4⁺-клеток в Th1-, Th2- или Th17-клетки. Согласно табл. 4 (PATH:ko04625), сигнальный путь через активацию рецепторов лектина C-типа регулируется мкРНК hsa-miR-16-5p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-223-3p путем посттранскрипционного воздействия на гены-мишени CHUK, KRAS, PTGS2, RAF1, TNF, IL-6. Недавние исследования выявили сниженную продукцию Th1-цитокинов и повышенную продукцию Th17-цитокинов у новорожденных в сравнении со взрослыми людьми [21]. H.-C. Huang и соавт. обнаружили повышенный уровень IL-8 и TNF-α в крови новорожденных в сравнении со взрослыми людьми [22, 23]. Важно отметить, что при неонатальных инфекциях повышенный уровень провоспалительных цитокинов коррелирует с частотой смертельных исходов [24, 25].

Нельзя не отметить возможную роль анализируемых мкРНК в сигнальном пути, опосредованном Toll-подобными рецепторами (PATH:ko04620, см. табл. 4), экспрессирующимися на клетках врожденного иммунитета (макрофаги, дендритные клетки) и связывающими мембранные компоненты грамотрицательных и грамположительных бактерий. Активация данных рецепторов приводит к синтезу провоспалительных цитокинов (например, TNF и IL-6) и хемокинов (в том числе CCL3) посредством действия митоген-активируемых киназ (MAP2K4) и регуляторов NFKB (CHUK). Распознавание патогенной инфекции осуществляется и цитозольными NOD-подобными рецепторами (PATH:ko04621, см. табл. 4), обусловливая синтез цитокинов IL-6, IL-18, TNF путем активации NFKB и MAPK с участием белков XIAP и CHUK, в то время как продукция цитокинов воспаления IL-1P и IL-18 в сигнальном пути, опосредованном NOD-подобными рецепторами, происходит под действием каспазы-1 через формирование мультибелкового комплекса - инфламмосомы, регулируемого белком BCL2. Ключевая роль hsa-miR-16-5p в про-дукции провоспалительных цитокинов и инициации хемотаксиса макрофагами и дендритными клетками путем регуляции сигнального пути, опосредованного Toll-подобными рецепторами, была доказана Xiaoliang Wang и соавт. [26]. Авторы данной работы обнаружили снижение уровня экспрессии генов TLR4 (Toll-подобный рецептор 4) и IRAK1 (ассоциированная с рецептором к интерлейкину 1 киназа 1) в обработанных LPS клетках RAW264.7, трансфецированных миметиками miRNA-15a и miRNA-16 в экспериментах in vitro, равно как и достоверное троекратное повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p в сыворотке периферической крови доношенных детей с РНС в возрасте 7-21 сут жизни. При этом ключевая роль IL-18 в патофизиологии сепсиса, в том числе связь повышенного уровня сывороточного IL-18 с неблагоприятным клиническим исходом была доказана во многих исследованиях [27-30]. Регулятором экспрессии IL-18 является miR-130a, уровень которой резко снижается в плазме крови у пациентов с тяжелым сепсисом, осложненным тромбоцитопенией [31].

В настоящем исследовании в 1-й группе новорожденных в первые сутки жизни выявлено достоверное повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p у детей с РНС и ВЖК по сравнению с детьми с РНС без ВЖК. Причем при использовании непараметрического метода ранговой корреляции по Спирмену была выявлена достоверная отрицательная корреляция между значением ACt hsa-miR-16-5p и наличием ВЖК у новорожденных (r=-0,4717, p=0,0037), т.е. повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p коррелировало с наличием ВЖК у детей с РНС, рожденных на сроке 25-28 нед беременности. Связь изменения содержания hsa-miR-16-5p в плазме крови у детей и наличием ВЖК в неонатальный период выявлена нами впервые. Важно отметить, что у недоношенных детей поражения центральной нервной системы доминируют среди причин инвалидизации и смертности, среди которых ВЖК встречаются в 60-90% случаев. Среди детей с ОНМТ при рождении при отсутствии ВЖК летальность составляет 6,5%, в то время как при ВЖК II-III степени летальность достигает 70% вследствие развития постгеморрагической гидроцефалии. В связи с этим найденный нами мкРНК-маркер ВЖК у детей с РНС при ОНМТ может быть использован для ранней неинвазивной диагностики ВЖК, что подчеркивает значимость настоящего исследования в клинической практике.

Основными механизмами патогенеза ВЖК, по мнению Р. Ballabh и соавт. [19], являются: 1) нарушения мозгового кровотока; 2) склонность сосудов герминативного матрикса к повреждениям вследствие нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера при гипоксии-ишемии и сепсисе и 3) нарушения функции тромбоцитарного и коагуляционного звена вследствие недостаточности гемостаза. Регуляция системы гемостаза осуществляется сложнейшими механизмами, в которых принимают участие факторы свертывающей, противосвертывающей и фибринолитической систем крови. В свертывающей системе ключевым ферментом является тромбин, обеспечивающий формирование фибринового сгустка, а в системе фибринолиза - плазмин, под действием которого происходит разрушение фибрина [32]. К наиболее значимым физиологическим антикоагулянтам относятся антитромбин III, система протеина С, ингибитор пути тканевого фактора и α2-макроглобулин [33]. Нарушение межсистемных взаимосвязей может привести к тяжелым патологическим состояниям организма, заключающимся или в повышенной кровоточивости, или во внутрисосудистом тромбообразовании. По литературным данным, важным регулятором системы свертывания крови является miR-122, сывороточный уровень которой при сепсисе коррелировал с антитромбином III (r=-0,913, р<0,001), временем образования и активности тромбопластина (r=0,426, p=0,008) и фибриногеном (r=0,398, p=0,008) [34].

Согласно табл. 4, hsa-miR-16-5p регулирует каскады реакций коагуляции и активации комплемента (PATH:ko04610) и тромбоцитов (PATH:ko04611) путем взаимодействия с мРНК генов-мишеней протромбина (F2) и интегрина альфа-2 (ITGA2) соответственно. Последний отвечает за адгезию тромбоцитов к коллагену при нарушении целостности сосудистой стенки, их активации с последующим повышением внутриклеточного кальция и запуску Rap1-сигнального пути, что приводит к реализации фибриноген-связывающей функции интегрина альфа(Ш)бета(3) и ретракции фибринового сгустка. В свою очередь, тромбин, помимо выполнения основной задачи - превращения растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин, влияет на проницаемость эндотелия, стимулирует хемотаксис лейкоцитов и продукцию провоспалительных цитокинов, что является важным компонентом воспаления и отека в ткани [35, 36]. Клеточные эффекты тромбина осуществляются через PAR-рецепторы. Активация PAR1, основного рецептора тромбина, может приводить либо к индукции, либо к ингибированию апоптоза эпителиальных и нейрональных клеток в зависимости от концентрации тромбина [33, 37]. Ряд исследований показал, что тромбин в высокой (100 пМ), но не низкой (50 пМ), концентрации может разрушать эндотелиальный барьер путем активации PAR1 [38].

Согласно табл. 4 (PATH:ko04062), важную роль в регуляции хемокин-опосредованных реакций играет не только hsa-miR-16-5p, но и hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-223-3p. Доставку лейкоцитов к участкам воспаления, их выживание, пролиферацию и дифференцировку осуществляют хемокины (например, CCL3 и CCL8), которые взаимодействуют с рецепторами, сопряженными с G-белками, и активируют: либо 1) ГТФазу KRAS с последующей активацией белков семейства Raf (RAF1), фосфорилированием ERK1/2 и индукцией генов раннего ответа, либо 2) фосфатидилинозитол-3-киназу с последующим вовлечением транскрипционных факторов FOXO3 и NFKB (в том числе регулятора его активности - CHUK), либо 3) тирозинкиназ JAK, фосфорилирующих транскрипционные факторы STAT (в том числе STAT3). В работе Xiaohong Wang и соавт. было выявлено негативное влияние miR-223 на уровень экспрессии STAT-3 и IL-6, и на мышиной модели тяжелого сепсиса у мышей с делецией гена, кодирующего miR-223, было продемонстрировано индуцированное сепсисом увеличение сердечной недостаточности, воспаления и смертности [39]. Роль miR-92a в воспалительных реакциях и дисфункции эндотелия, наряду со значимым повышением уровня ее экспрессии в цельной крови при остром РДС у взрослых пациентов и в легочной ткани в мышиной модели LPS-индуцированного острого воспаления легких, была выявлена в ряде исследований [40-42].

Таким образом, полученные в настоящей работе данные являются весомым дополнением к имеющимся результатам анализа роли мкРНК в патофизиологии неонатальных заболеваний, в частности неонатального сепсиса.

Заключение

Впервые продемонстрирована клиническая значимость изменения уровня hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в плазме крови новорожденных различного гестационного возраста в диагностике ВП, РНС и ВЖК. Использование в неонатологической практике оценки уровня экспрессии мкРНК в плазме крови новорожденных в сочетании с традиционным клинико-лабораторным обследованием позволит обеспечить более точную и раннюю диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний, таких как ВП и РНС, в особенности у глубоконедоношенных детей.

Благодарность. 81 образец плазмы периферической крови новорожденных, включенных в исследование, предоставлен Муллабаевой Светланой Мининхаевной, заведующей лабораторией по сбору и хранению биоматериалов ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова" Минздрава России.

Финансирование работы осуществлено за счет госзадания (регистрационный номер 116082210002) по теме "Изучение диагностической и прогностической роли молекулярно-генетических, иммунологических, эпигенетических факторов в развитии преэклампсии".

Литература

1. Camacho-Gonzalez A., Spearman P.W., Stoll B.J. Neonatal infectious diseases: evaluation of neonatal sepsis // Pediatr. Clin. North Am. 2013. Vol. 60, N 2. P. 367-389.

2. Vasilcan G., Avasiloaiei A., Moscalu M., Dimitriu A.G. et al. Procalci-tonine-early marker of neonatal infection // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi. 2011. Vol. 115, N 4. P. 1243-1250.

3. Wynn J.L., Levy O. Role of innate host defenses in susceptibility to early-onset neonatal sepsis // Clin. Perinatol. 2010. Vol. 37. P. 307-337.

4. Wynn J., Cornell T.T., Wong H.R., Shanley T.P. et al. The host response to sepsis and developmental impact // Pediatrics. 2010. Vol. 125, N 5. P. 1031-1041.

5. Watson R.S., Carcillo J.A., Linde-Zwirble W.T., Clermont G. et al. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003. Vol. 167, N 5. P. 695-701.

6. Futata E.A., Fusaro A.E., de Brito C.A., Sato M.N. The neonatal immune system immunomodulation of infections in early life // Expert Rev. Antiinfect. Ther. 2012. Vol. 10. P. 289-298.

7. Wilson C., Penix L., Weaver W., Melvin A. et al. Ontogeny of T lymphocyte function in the neonate // Am. J. Reprod. Immunol. 1992. Vol. 28. P. 132-135.

8. Kotiranta-Ainamo A., Apajasalo M., Pohjavuori M., Rautonen N. et al. Mononuclear cell subpopulations in preterm and full-term neonates: independent effects of gestational age, neonatal infection, maternalpre-eclampsia, maternal betamethasone therapy, and mode of delivery // Clin. Exp. Immunol. 1999. Vol. 115. P. 309-314.

9. Juretic E., Uzarevic B., Petrovecki M., JureticA. Two-colour flow cytometric analysis of preterm and term newborn lymphocytes // Immunobiology. 2000. Vol. 202. P. 421-428.

10. Perez A., Gurbindo M.D., Resino S., Aguaron A. et al. NK cell increase in neonates from the preterm to the full-term period of gestation // Neonatology. 2007. Vol. 92, N 3. P. 158-163.

11. Timofeeva A.V., Gusar V.A., Kan N.E., Prozorovskaya K.N. et al. Identification of potential early biomarkers of preeclampsia // Placenta. 2018. Vol. 61. P. 61-71.

12. Жукова А.С., Ванько Л.В., Никитина И.В., Балашова Е.Н. и др. Содержание цитокинов в плазме крови недоношенных новорожденных детей в раннем неонатальном периоде // Иммунология. 2017. Т. 38, № 3. С. 143-147.

13. Никитина И.В., Ионов О.В., Милая О.В. Прокальцитонин в диагностике инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных // Неонатология. 2014. № 4. С. 96-103.

14. Janota J., Stranak Z., Statecna B., Dohnalova A. et al. Characterization of multiple organ dysfunction syndrome in very low birthweight infants: a new sequential scoring system // Shock. 2001. Vol. 15, N 5. P. 348-352.

15. Серебрякова Е.Н., Волосников Д.К. Использование шкалы NEOMOD для оценки тяжести состояния новорожденных с полиорганной недостаточностью // Вопр. практ. педиатрии. 2010. Т. 5, № 5. С. 37-39.

16. Кусельман А.И., Самсыгина Г.А. Оценка состояния тяжести больных детей // Педиатрия. 2012. Т. 91, № 4. С. 115-121.

17. Levy O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates // Nat. Rev. Immunol. 2007. Vol. 7. P. 379-390.

18. Kollmann T.R., Levy O., Montgomery R.R., Goriely S. Innate immune function by Toll-like receptors: distinct responses in newborns and the elderly // Immunity. 2012. Vol. 37. P. 771-783.

19. Ballabh Р. Intraventricular hemorrhage in premature infants: mechanism of disease // Pediatr. Res. 2010. Vol. 67, N 1. P. 1-8.

20. Mikami Y., Kanno Y. GoldiRunx and remembering cytotoxic memory // Immunity. 2018. Vol. 48, N 4. P. 614-615.

21. Kollmann T.R., Crabtree J., Rein-Weston A., Blimkie D. et al. Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults // J Immunol. 2009. Vol. 183, N 11. P. 7150-7160.

22. Huang H.C., Tai F.Y., Wang F.S., Liu C.A. et al. Correlation of augmented il-8 production to premature chronic lung disease: implication of posttranscriptional regulation // Pediatr. Res. 2005. Vol. 58, N 2. P. 216-221.

23. Huang H.C., Yu H.R., Huang L.T., Huang H.C. et al. miRNA-125b regulates TNF-a production in CD14+ neonatal monocytes via post-transcriptional regulation // J. Leukoc. Biol. 2012. Vol. 92, N 1. P. 171-182.

24. Krueger M., Nauck M.S., Sang S., Hentschel R. et al. Cord blood levels of interleukin-6 and interleukin-8 for the immediate diagnosis of early-onset infection in premature infants // Biol. Neonate. 2001. Vol. 80, N 2. P. 118-123.

25. Santana C., Guindeo M.C., Gonzalez G., Garcia-Munoz F. et al. Cord blood levels of cytokines as predictors of early neonatal sepsis // Acta Paediatr. 2001. Vol. 90, N 10. P. 1176-1181.

26. Wang X., Wang X., Liu X., Wang X. et al. miR-15a/16 are upreug-lated in the serum of neonatal sepsis patients and inhibit the LPS-induced inflammatory pathway // Int. J. Clin. Exp. Med. 2015. Vol. 8, N 4. P. 56835690.

27. Tschoeke S.K., Oberholzer A., Moldawer L.L. Interleukin-18: a novel prognostic cytokine in bacteria-induced sepsis // Crit. Care Med. 2006. Vol. 34. P. 1225-1233.

28. Lamkanfi M., Sarkar A., Vande Walle L. et al. Inflammasome-depen-dent release of the alarmin HMGB1 in endotoxemia // J. Immunol. 2010. Vol. 185. P. 4385-4392.

29. Hochholzer P., Lipford G.B., Wagner H., Pfeffer K. et al. Role of interleukin-18 (IL-18) during lethal shock: decreased lipopolysac-charide sensitivity but normal superantigen reaction in IL-18-deficient mice // Infect. Immun. 2000. Vol. 68. P. 3502-3508.

30. Opal S.M. Dual inhibition of interleukin-1p and interleukin-18: a new treatment option for sepsis? // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2014. Vol. 189. P. 242-244.

31. Zhao H., Li H., Du W. et al. Reduced MIR130A is involved in pri-mary immune thrombocytopenia via targeting TGFB1 and IL18 // Br. J. Haematol. 2014. Vol. 166, N 5. P. 767-773.

32. Hoffman M., Monroe D.M. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis // Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2007. Vol. 21, N 1. P. 1-11. Review.

33. Versteeg H.H., Heemskerk J.W., Levi M., Reitsma P.H. New fundamentals in hemostasis // Physiol. Rev. 2013. Vol. 93, N 1. P. 327-358.

34. Wang H.J., Deng J., Wang J.Y., Zhang P.J. et al. Serum miR-122 levels are related to coagulation disorders in sepsis patients // Clin. Chem. Lab. Med. 2014. Vol. 52, N 6. P. 927-933.

35. Tsopanoglou N.E., Maragoudakis M.E. Thrombin's central role in angiogenesis and pathophysiological processes // Eur. Cytokine Netw. 2009. Vol. 20, N 4. P. 171-179. Review.

36. D'Audigier C., Cochain C., Rossi E., Guerin C.L. et al. Thrombin receptor PAR-1 activation on endothelial progenitor cells enhances chemotaxis-associated genes expression and leukocyte recruitment by a COX-2-dependent mechanism // Angiogenesis. 2015. Vol. 18, N 3. P. 347359.

37. Zania P., Papaconstantinou M., Flordellis C.S., Maragoudakis M.E. et al. Thrombin mediates mitogenesis and survival of human endothelial cells through distinct mechanisms // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2008. Vol. 294, N 5. P. C1215-C1226.

38. Bae J.S., Yang L., Manithody C., Rezaie A.R. The ligand occupancy of endothelial protein C receptor switches the protease-activated receptor 1-dependent signaling specificity of thrombin from a permeability-enhancing to a barrier-protective response in endothelial cells // Blood. 2007. Vol. 110, N 12. P. 3909-3916.

39. Wang X., Huang W., Yang Y., Wang Y. et al. Loss of duplexmiR-223 (5p and 3p) aggravates myocardial depression and mortality in polymicrobial sepsis // Biochim. Biophys. Acta. 2014. Vol. 1842, N 5. P. 701-711.

40. Loyer X., Potteaux S., Vion A.C., Guerin C.L. et al. Inhibition of microRNA-92a prevents endothelial dysfunction and atherosclerosis in mice // Circ. Res. 2014. Vol. 114, N 3. P. 434-443.

41. Fu L., Zhu P., Qi S., Li C. et al. MicroRNA-92a antagonism attenuates lipopolysaccharide (LPS)-induced pulmonary inflammation and injury in mice through suppressing the PTEN/AKT/NF-kB signaling pathway // Biomed. Pharmacother. 2018. Vol. 107. P. 703-711.

42. Zhu Z., Liang L., Zhang R., Wei Y. et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome // Intensive Care Med. Exp. 2017. Vol. 5, N 1. P. 38.

References

1. Camacho-Gonzalez A., Spearman P.W., Stoll B.J. Neonatal infectious diseases:evaluation of neonatal sepsis. Pediatr Clin North Am. 2013; 60 (2): 367-89.

2. Vasilcan G., Avasiloaiei A., Moscalu M., Dimitriu A.G., et al. Procalci-tonine-early marker of neonatal infection. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2011; 115 (4): 1243-50.

3. Wynn J.L., Levy O. Role of innate host defenses in susceptibility to early-onset neonatal sepsis. Clin Perinatol. 2010; 37: 307-37.

4. Wynn J., Cornell T.T., Wong H.R., Shanley T.P., et al. The host response to sepsis and developmental impact. Pediatrics. 2010; 125 (5): 1031-41.

5. Watson R.S., Carcillo J.A., Linde-Zwirble W.T., Clermont G., et al. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States. Am J Respir Crit Care Med. 2003; 167 (5): 695-701.

6. Futata E.A., Fusaro A.E., de Brito C.A., Sato M.N. The neonatal immune system immunomodulation of infections in early life. Expert Rev Anti Infect Ther. 2012; 10: 289-98.

7. Wilson C., Penix L., Weaver W., Melvin A., et al. Ontogeny of T lymphocyte function in the neonate. Am J Reprod Immunol. 1992; 28: 132-5.

8. Kotiranta-Ainamo A., Apajasalo M., Pohjavuori M., Rautonen N., et al. Mononuclear cell subpopulations in preterm and full-term neonates: independent effects of gestational, age, neonatal infection, maternalpre-eclampsia, maternal betamethasone therapy, and mode of delivery. Clin Exp Immunol. 1999; 115: 309-14.

9. Juretic E., Uzarevic B., Petrovecki M., JureticA. Two-colour flow cytometric analysis of preterm and term newborn lymphocytes. Immunobiology. 2000; 202: 421-8.

10. Perez A., Gurbindo M.D., Resino S., Aguaron A., et al. NK cell increase in neonates from the preterm to the full-term period of gestation. Neonatology. 2007; 92 (3): 158-63.

11. Timofeeva A.V., Gusar V.A., Kan N.E., Prozorovskaya K.N., et al. Identification of potential early biomarkers of preeclampsia // Placenta. 2018; 61: 61-71.

12. Zhukova A.S., Van'ko L.V., Nikitina I.V., Balashova E.N., et al. Plasma cytokine levels in preterm newborns in the early neonatal period. Immunologiya [Immunology]. 2017; 38 (3): 143-7. (in Russian)

13. Nikitina I.V., Ionov O.V., Milaya O.V. Procalcitonin in the diagnosis of infectious and inflammatory diseases in newborns. Neonatologiya [Neonatology]. 2014; 4: 96-103. (in Russian)

14. Janota J., Stranak Z., Statecna B., Dohnalova A., et al. Characterization of multiple organ dysfunction syndrome in very low birth-weight infants: a new sequential scoring system. Shock. 2001; 15 (5): 348-52.

15. Serebryakova E.N., Volosnikov D.K. Using NEOMOD scores to evaluate the severity of the condition of newborns with multiple organ dysfunction. Voprosy prakticheskoy pediatrii [Problems of Practical Pediatrics]. 2010; 5 (5): 37-9. (in Russian)

16. Kuselman A.I., Samsygina G.A. Estimation of state criticality in ill children. Pediatriya [Pediatrics]. 2012; 91 (4): 115-21. (in Russian)

17. Levy O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 2007; 7: 379-90.

18. Kollmann T.R., Levy O., Montgomery R.R., Goriely S. Innate immune function by Toll-like receptors: distinct responses in newborns and the elderly. Immunity. 2012; 37: 771-83.

19. Ballabh Р. Intraventricular hemorrhage in premature infants: mechanism of disease. Pediatr Res. 2010; 67 (1): 1-8.

20. Mikami Y., Kanno Y. GoldiRunx and remembering cytotoxic memory. Immunity. 2018; 48 (4): 614-5.

21. Kollmann T.R., Crabtree J., Rein-Weston A., Blimkie D., et al. Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults. J Immunol. 2009; 183 (11): 7150-60.

22. Huang H.C., Tai F.Y., Wang F.S., Liu C.A., et al. Correlation of augmented IL-8 production to premature chronic lung disease: implication of posttranscriptional regulation. Pediatr Res. 2005; 58 (2): 216-21.

23. Huang H.C., Yu H.R., Huang L.T., Huang H.C., et al. miRNA-125b regulates TNF-a production in CD14+ neonatal monocytes via post-transcriptional regulation. J Leukoc Biol. 2012; 92 (1): 171-82.

24. Krueger M., Nauck M.S., Sang S., Hentschel R., et al. Cord blood levels of interleukin-6 and interleukin-8 for the immediate diagnosis of early-onset infection in premature infants. Biol Neonate. 2001; 80 (2): 118-23.

25. Santana C., Guindeo M.C., Gonzalez G., Garcia-Munoz F., et al. Cord blood levels of cytokines as predictors of early neonatal sepsis. Acta Paediatr. 2001; 90 (10): 1176-81.

26. Wang X., Wang X., Liu X., Wang X., et al. miR-15a/16 are upreug-lated in the serum of neonatal sepsis patients and inhibit the LPS-induced inflammatory pathway. Int J Clin Exp Med. 2015; 8 (4): 5683-90.

27. Tschoeke S.K., Oberholzer A., Moldawer L.L. Interleukin-18: a novel prognostic cytokine in bacteria-induced sepsis. Crit Care Med. 2006; 34: 1225-33.

28. Lamkanfi M., Sarkar A., Vande Walle L., et al. Inflammasome-de-pendent release of the alarmin HMGB1 in endotoxemia. J Immunol. 2010; 185: 4385-92.

29. Hochholzer P., Lipford G.B., Wagner H., Pfeffer K., et al. Role of interleukin-18 (IL-18) during lethal shock: decreased lipopolysac-charide sensitivity but normal superantigen reaction in IL-18-deficient mice. Infect Immun. 2000; 68: 3502-8.

30. Opal S.M. Dual inhibition of interleukin-1p and interleukin-18: a new treatment option for sepsis? Am J Respir Crit Care Med. 2014; 189: 242-4.

31. Zhao H., Li H., Du W., et al. Reduced MIR130A is involved in primary immune thrombocytopenia via targeting TGFB1 and IL18. Br J Haematol. 2014; 166 (5): 767-73.

32. Hoffman M., Monroe D.M. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematol Oncol Clin North Am. 2007; 21 (1): 1-11. Review.

33. Versteeg H.H., Heemskerk J.W., Levi M., Reitsma P.H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 2013; 93 (1): 327-58.

34. Wang H.J., Deng J., Wang J.Y., Zhang P.J., et al. Serum miR-122 levels are related to coagulation disorders in sepsis patients. Clin Chem Lab Med. 2014; 52 (6): 927-33.

35. Tsopanoglou N.E., Maragoudakis M.E. Thrombin's central role in angiogenesis and pathophysiological processes. Eur Cytokine Netw. 2009; 20 (4): 171-9. Review.

36. d'Audigier C., Cochain C., Rossi E., Guerin C.L., et al. Thrombin receptor PAR-1 activation on endothelial progenitor cells enhances che-motaxis-associated genes expression and leukocyte recruitment by a COX-2-dependent mechanism. Angiogenesis. 2015; 18 (3): 347-59.

37. Zania P., Papaconstantinou M., Flordellis C.S., Maragoudakis M.E., et al. Thrombin mediates mitogenesis and survival of human endothelial cells through distinct mechanisms. Am J Physiol Cell Physiol. 2008; 294 (5): C1215-26.

38. Bae J.S., Yang L., Manithody C., Rezaie A.R. The ligand occupancy of endothelial protein C receptor switches the protease-activated receptor 1-dependent signaling specificity of thrombin from a permeability-enhancing to a barrier-protective response in endothelial cells. Blood. 2007; 110 (12): 3909-16.

39. Wang X., Huang W., Yang Y., Wang Y., et al. Loss of duplexmiR-223 (5p and 3p) aggravates myocardial depression and mortality in polymicrobial sepsis. Biochim Biophys Acta. 2014; 1842 (5): 701-11.

40. Loyer X., Potteaux S., Vion A.C., Guerin C.L., et al. Inhibition of microRNA-92a prevents endothelial dysfunction and atherosclerosis in mice. Circ Res. 2014; 114 (3): 434-43.

41. Fu L., Zhu P., Qi S., Li C., et al. MicroRNA-92a antagonism attenuates lipopolysaccharide (LPS)-induced pulmonary inflammation and injury in mice through suppressing the PTEN/AKT/NF-kB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2018; 107: 703-11.

42. Zhu Z., Liang L., Zhang R., Wei Y., et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med Exp. 2017; 5 (1): 38.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)